Tải bản đầy đủ - 73 (trang)
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ - 73trang

Máy cô quay Rotavapor R-200 (Buchi, Thụy Sĩ), bếp điện, bếp đun cách

thủy Memmert, máy siêu âm Power sonic 450 (Hwashin, Hàn Quốc), cột thủy tinh.

Tủ sấy Memmert (Đức), tủ sấy Binder-FD115 (Binder, Đức). Máy đo độ nóng chảy

Kofler micro-hotstage.

Máy đo phổ:

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Brucker Avance 500Hz (Viện Hóa Học).

+ Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết (HMBC).

Pha tĩnh dùng trong sắc kí cột là Silicagel pha thường (0,040-0,063 mm,

Merk). Bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merk) (Silica gel; 0,25 mm) và

bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merk; 0,25 mm). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở

2 bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử để phát hiện chất.

2.2.



Nội dung nghiên cứu



2.2.1. Nội dung nghiên cứu đặc điểm thực vật

Mô tả đặc điểm hình thái của mẫu cây Nho rừng thu hái ở Lào Cai.

Giám định tên khoa học của cây Nho rừng.

Mô tả đặc điểm vi học của mẫu.

2.2.2. Nội dung nghiên cứu hóa học

Định tính sơ bộ các nhóm chất thường gặp trong phần trên mặt đất của cây

Nho rừng bằng các phản ứng hóa học đặc trưng.

Bước đầu khảo sát, phân lập thành phần có trong phân đoạn n-hexan của

phần trên mặt đất của cây Nho rừng bằng phương pháp sắc kí cột.

2.3.



Phương pháp nghiên cứu



2.3.1. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm thực vật

Nghiên cứu đặc điểm hình thái thực vật tại thực địa và trong phòng thí

nghiệm, mô tả đặc điểm theo hướng dẫn [3].

Giám định tên khoa học của mẫu: thu mẫu Nho rừng ở Lào Cai, sau đó được

xử lý và làm tiêu bản và đối chiếu với các mô tả trong các tài liệu thực vật chuyên

sâu [5], [39]. Tiêu bản mẫu tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật: nhờ chuyên



20



gia giám định tên khoa học của cây, các tiêu bản sau khi giám định tên khoa học

được đưa vào lưu trữ tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật.

Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu: thân, lá được cắt, tẩy, nhuộm tiêu bản theo

phương pháp nhuộm kép. Quan sát cấu tạo vi phẫu thân, lá và đặc điểm bột thân,

bột lá bằng kính hiển vi, chụp ảnh các đặc điểm vi học bằng máy ảnh theo phương

pháp trong các tài liệu [1], [2].

2.3.2. Phương pháp định tính các nhóm chất trong dược liệu

Định tính sơ bộ các nhóm chất bằng các phản ứng đặc trưng của từng nhóm

chất trong tài liệu [1], [2].

2.3.2.1.



Định tính alkaloid



Cho 5g bột dược liệu vào bình cầu dung tích 50 ml. Thêm 15 ml dung dịch

H2SO4 1N. Đun cách thủy tới sôi. Để nguội. Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích

100 ml. Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N (khoảng 8ml) đến pH= 9-10

(thử bằng giấy quỳ hoặc chỉ thị màu vạn năng). Chiết alkaloid base bằng chloroform

(chiết 3 lần, mỗi lần 5 ml). Gộp các dịch chiết chloroform, loại nước bằng Na2SO4

khan. Lắc dịch chiết chloroform với acid H2SO4 1N (2 lần, mỗi lần 5ml). Gộp các

dịch chiết acid, cho vào 3 ống nghiệm nhỏ (mỗi ống 1ml) để làm các phản ứng sau:

 Phản ứng với thuốc thử Mayer: thêm 2-3 giọt thuốc thử Mayer vào ống nghiệm,

nếu thấy tủa màu từ trắng đến vàng thì phản ứng dương tính

 Phản ứng với thuốc thử Bouchardat: thêm 2-3 giọt thuốc thử Bouchardat vào

ống nghiệm, nếu thấy xuất hiện tủa nâu đến đỏ nâu thì phản ứng dương tính.

 Phản ứng với thuốc thử Dragendorff: thêm 2-3 giọt thuốc thử Dragendorff vào

ống nghiệm, nếu xuất hiện tủa vàng cam đến đỏ thì dương tính.

2.3.2.2.



Định tính glycosid tim



Cân khoảng 10 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 250 ml, thêm vào

100 ml ethanol 25% rồi đun cách thủy 30 phút. Lọc dịch chiết vào cốc có mỏ dung

tích 100 ml, thêm vào dịch chiết 3ml chì acetat 30%, khuấy đều. Lọc qua giấy lọc

gấp nếp vào một cốc có mỏ khác. Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào một ống

nghiệm, thêm 1 giọt chì acetat 30% vào. Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, cho thêm



21



1ml chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy và lọc lại. Tiếp tục thử cho đến khi không

còn tủa với chì acetat nữa.

Chuyển toàn bộ dịch lọc vào bình gạn và lắc kĩ với chloroform (2 lần, mỗi

lần 8ml), gạn lấy lớp chloroform vào cốc có mỏ khô sạch. Gộp dịch chiết

chloroform và loại nước bằng Na2SO4 khan. Chia dịch chiết vào các ống nghiệm và

bốc hơi cách thủy đến cắn để thực hiện các phản ứng sau:

 Phản ứng Liebermann- Burchardt: hòa cắn trong ống nghiệm 1 với 1 ml

anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết. Nghiêng ống 45°, cho từ từ theo thành ống

1 ml H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Quan sát nếu ở mặt tiếp xúc

giữa 2 lớp chất lỏng có một vòng màu tím đỏ xuất hiện, lớp chất lỏng phía trên

màu hồng, lớp chất lỏng phía dưới màu xanh lá thì phản ứng dương tính.

 Phản ứng Baljet: hòa cắn trong ống nghiệm 2 với 1 ml ethanol 90%, lắc đều cho

đến tan hết. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha ( acid picric 1%: NaOH

10%= 1:9) nếu thấy xuất hiện màu đỏ cam thì phản ứng dương tính.

 Phản ứng Legal: hòa tan cắn ống nghiệm 2 với 0,5 ml ethanol 90%, lắc kĩ cho

tan hết. Nhỏ 1 giọt thuốc thử Natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH

10%, lắc đều nếu thấy xuất hiện màu đỏ cam thì phản ứng dương tính.

2.3.2.3.



Định tính saponin



Quan sát hiện tượng tạo bọt: Cho vào ống ngiệm lớn 0,1g bột dược liệu,

thêm 5 ml nước, bịt tay bằng ngón tay cái, lắc mạnh trong 5 phút theo chiều dọc, để

yên và quan sát nếu thấy cột bọt bền vững sau 15 phút thì dương tính.

Phản ứng Salkowski: Lấy 10 ml dịch chiết cồn cho vào bình nón và thêm 10

ml H2SO4 loãng. Đun sôi cách thủy vài phút. Để nguội, chiết với chloroform rồi cho

vào ống nghiệm. Thêm từ từ 1 ml H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm, quan sát nếu

thấy giữa 2 lớp xuất hiện vòng màu xanh lá thì phản ứng dương tính.

Phản ứng Liebermann- Burchardt: Lấy 1 ml dịch chiết chloroform ở trên cho

vào 1 ống nghiệm rồi cô cách thủy tới cắn. Cho vào cắn 0,5 ml anhydrid acetic, lắc

đều, đặt nghiêng ống 45° rồi thêm 0,5 ml acid H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm để



22



dịch lỏng trong ống chia thành 2 lớp, quan sát nếu thấy mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất

lỏng trong ống nghiệm có màu đỏ thì phản ứng dương tính.

2.3.2.4.



Định tính flavonoid



Chiết xuất: Cho 0,5g bột dược liệu vào ống nghiệm lớn. Thêm 5 ml ethanol

90%, đun sôi cách thủy vài phút. Lọc nóng, dịch lọc được tiến hành các phản ứng:

Phản ứng Cyanidin: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết, thêm 1 ít bột

magie (khoảng 10mg) vào. Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc vào (3-5 giọt) nếu dung

dịch chuyển từ màu vàng sang đỏ thì phản ứng dương tính.

Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: Cho 1 ml dịch chiết ethanol vào một ống

nghiệm, thêm vài giọt FeCl3 5% nếu thấy xuất hiện tủa xanh đen thì phản ứng

dương tính.

Phản ứng với kiềm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm vài giọt

NaOH 10% nếu thấy xuất hiện tủa màu vàng, thêm nước tủa tan và màu dung dịch

tăng lên thì phản ứng dương tính.

2.3.2.5.



Định tính coumarin



Chiết xuất: Cho 1 g bột dược liệu vào ống nghiệm lớn, thêm 5 ml ethanol

90% vào quấy đều. Đun sôi cách thủy khoảng 5 phút, lọc nóng qua giấy lọc. Dịch

lọc tiến hành phản ứng:

 Phản ứng mở và đóng vòng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch

chiết. Ống 1: thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%, ống 2: để nguyên.

Đun cả 2 ống nghiệm cách thủy đến sôi, để nguội rồi quan sát: ống 1: có màu

vàng hoặc tủa đục màu vàng thì phản ứng dương tính, ống 2: trong.

Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml nước cất, lắc đều rồi quan sát

-



Ống 1: trong suốt thì phản ứng dương tính.



-



Ống 2: có tủa đục



 Phản ứng diazo hóa: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm vào 2 ml NaOH

10%. Đun cách thủy tới sôi rồi để nguội. Nhỏ vài giọt thuốc thử diazo mới pha,

nếu xuất hiện màu đỏ gạch thì phản ứng dương tính.



23



 Phản ứng chuyển dạng cis-trans: Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên giấy lọc, nhỏ tiếp

thêm 1 giọt NaOH 5%, sấy nhẹ. Che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc

bằng một miếng kim loại rồi chiếu tia tử ngoại trong 2 phút. Bỏ miếng kim loại

ra, quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại thấy phần không bị che sáng dần lên, sau vài

phút cả hai đều sáng như nhau thì phản ứng dương tính.

2.3.2.6.



Định tính anthranoid



Chiết xuất: cho 2 g bột dược liệu vào ống nghiệm, thêm 5 ml H2SO4 1N. Đun

sôi trực tiếp đến sôi, lọc nóng dịch chiết vào bình gạn dung tích 50 ml. Để nguội

dịch lọc, chiết với chloroform (5 ml).

Phản ứng Borntraeger: Lấy 1 ml dịch chiết chloroform cho vào ống nghiệm,

thêm 1 ml NaOH 10%. Lắc kỹ, quan sát nếu thấy lớp NaOH có màu đỏ sim thì phản

ứng dương tính.

2.3.2.7.



Định tính tannin



Chiết xuất: Cho 1 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 20 ml

nước cất, đun sôi trong 2 phút. Để nguôi, lọc. Dịch lọc dùng để định tính:

 Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch lọc, thêm 2

giọt FeCl3 5%, nếu xuất hiện màu hoặc tủa xanh đen hoặc xanh nâu nhạt thì

phản ứng dương tính.

 Phản ứng với dung dịch Pb(CH3COO)2 10%: Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch

lọc, thêm 2 giọt Pb(CH3COO)2 10%, nếu xuất hiện tủa bông thì phản ứng dương

tính.

 Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch lọc, thêm 5

giọt gelatin 1%, nếu xuất hiện tủa bông trắng thì phản ứng dương tính.

 Phản ứng với dung dịch Cu(CH3COO)2: Cho 2 ml dịch lọc vào ống nghiệm,

thêm 2 giọt Cu(CH3COO)2, nếu xuất hiện tủa bông màu nâu thì phản ứng dương

tính.

2.3.2.8.



Định tính acid amin



24



Lấy 3 ml dịch chiết ethanol cho vào ống nghiệm. Thêm 2 giọt dung dịch

ninhydrin 3%, đun sôi cách thủy thấy dung dịch chuyển sang màu tím thì phản ứng

dương tính.

2.3.2.9.



Định tính acid hữu cơ



Cho vào ống nghiệm dịch chiết nước một ít tinh thể Na2CO3, nếu thấy xuất

hiện bọt khí thì phản ứng dương tính.

2.3.2.10. Định tính đường khử

Cho 2 ml dịch chiết nước vào ống nghiệm, thêm vào 3 giọt thuốc thử Fehling

A và Fehling B, đun cách thủy 10 phút thấy xuất hiện tủa đỏ gạch thì phản ứng

dương tính.

2.3.2.11. Định tính polysaccharid

Lấy 2 ống nghiệm sạch cho vào mỗi ống

 Ống 1: 4 ml nước cất và 5 giọt thuốc thử Lugol.

 Ống 2: 4 ml dịch chiết nước dược liệu và 5 giọt thuốc tử Lugol

Nếu thấy ống 2 xuất hiện màu nâu đỏ đậm hơn ống 1 thì phản ứng dương

tính.

2.3.2.12. Định tính chất béo

Nhỏ 2 giọt dịch chiết n-hexan lên giấy lọc, hơ nóng cho bay hơi hết dung

môi thấy để lại vết mờ trên giấy lọc thì phản ứng dương tính.

2.3.2.13. Định tính sterol

Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết n-hexan, bốc hơi dung môi đến khô.

Thêm vào ống nghiệm 1 ml anhydrid acetic, lắc kĩ. Để nghiêng ống nghiệm 45° nhỏ

từ từ dung dịch H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm. Quan sát nếu thấy giữa 2 lớp

chất lỏng xuất hiện vòng tím đỏ thì phản ứng dương tính

2.3.2.14. Định tính caroten

Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết n-hexan, bốc hơi cách thủy đến cắn,

thêm 2 giọt H2SO4 đặc vào cắn nếu thấy xuất hiện màu xanh thì phản ứng dương

tính.



25



2.3.3. Phương pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất phân

lập được

Dược liệu được chiết xuất bằng phương pháp chiết nóng với dung môi là

ethanol tuyệt đối. Dịch chiết ethanol được cất thu hồi dung môi thu được cao

ethanol toàn phần. Cao ethanol được phân tán trong nước nóng, chiết lỏng – lỏng

với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, ethyl acetat. Dịch chiết của

từng phân đoạn được cất thu hồi dung môi, thu được các cao phân đoạn tương ứng:

cao n-hexan, cao ethyl acetat, cao nước.

Phân lập các thành phần có trong cao phân đoạn n-hexan bằng phương pháp

sắc kí cột [1], [4].

Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được bằng cách đo nhiệt độ nóng

chảy, phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết (HMBC), phổ cộng hưởng từ hạt

nhân (1H-NMR,



13



C-NMR, DEPT)... và so sánh các dữ liệu thu được từ thực



nghiệm với các dữ liệu đã công bố.



26



Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1.



Nghiên cứu về thực vật



3.1.1. Đặc điểm hình thái thực vật và giám định tên khoa học của cây

Dây leo, thân và nhánh non có lông tơ như tơ nhện màu vàng- trắng, sau đó

nhẵn; cuống, mặt dưới lá và cụm quả có lông tơ như tơ nhện màu vàng nhạt; tua

cuốn đối diện với lá, xẻ đôi ở đỉnh, phủ lông tơ dạng mạng nhện dày đặc lúc non,

sau nhẵn. Lá đơn, mọc so le; lá kèm rụng sớm, có vết lá kèm ở gốc cuống lá; cuống

2-6 cm, phủ lông tơ dạng mạng nhện dày đặc, ngắn hơn rất nhiều so với phiến lá;

phiến lá hình bầu dục hoặc hình trứng, kích thước 4-10x3-7 cm, nguyên hoặc có 3

thùy nông; gốc lá hình tim hoặc cụt, mép lá có 19-22 đôi răng cưa nhọn, đỉnh nhọn

hoặc có mũi nhọn; gân lá hình chân vịt, gân từ gốc lá 5, gân giữa có 5-7 cặp, gân

cấp 3 song song, nổi rõ ở mặt dưới, hơi lõm ở mặt trên; mặt dưới lá phủ lông tơ màu

nâu xám, mặt trên có lông tơ dạng mạng nhện lúc non, sau nhẵn. Cụm quả chùm

kép, đối diện lá, dài 10-15cm, cuống cụm quả dài 3-4 cm, chia nhiều nhánh, các

nhánh phía dưới dài hơn các nhánh phía trên. Quả mọng hình cầu, kích thước không

đều trong cùng một cụm, đường kính 0.9-1.4 cm, khi chín màu tím đen, nhẵn, vị rất

chua. Hạt 3-4 trong một quả, hình trứng ngược, đỉnh tròn, gốc thuôn nhọn, hơi xẻ 2,

kích thước khoảng 6x4 mm; vỏ hạt nhẵn, mặt lưng có một đốm màu nâu ở giữa với

đường sọc màu vàng nâu kéo dài qua đỉnh sang hết mặt bụng đến gốc hạt, mặt bụng

có hai rãnh dọc xuất phát từ đỉnh hạt đến gần đỉnh, khía sâu vào hạt.

Dựa vào quan sát và phân tích các đặc điểm hình thái của mẫu, đối chiếu với

tài liệu tham khảo cùng sự giúp đỡ của TS. Nguyễn Thế Cường- Viện Sinh thái và

Tài nguyên sinh vật, cây Nho rừng dùng để nghiên cứu đã được giám định tên khoa

học là Vitis heyneana Roem. & Schult., họ Nho (Vitaceae). Tiêu bản mẫu sau khi

giám định được lưu tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật với số hiệu TL07.

Đặc điểm hình thái của mẫu cây nghiên cứu được minh họa ở hình 3.1.



27



Hình 3.1: Đặc điểm hình thái của cây Nho rừng

(Vitis heyneana Roem.& Schult.)

Chú thích: a. Cành mang lá, cụm quả; b. Thân già; c. Thân non; d. Tua cuốn; e. Lá;

f. Gốc lá; g. Ngọn lá; h. Cụm quả; i. Quả; j. Quả cắt ngang; k. Hạt (mặt bụng);

l. Hạt (mặt lưng); m. Hạt cắt ngang; n. Hạt cắt dọc

3.1.2. Đặc điểm vi học

3.1.2.1.



Đặc điểm vi phẫu thân



Vi phẫu thân có thiết diện tròn. Từ ngoài vào trong gồm: biểu bì cấu tạo bởi

1 hàng tế bào hình tròn xếp sát nhau, màng ngoài phủ 1 lớp cutin mỏng (1). Tiếp

theo là mô dày tập trung thành từng đám (2) cấu tạo bởi nhiều lớp tế bào thành dày

lên ở các góc (2). Mô mềm rất mỏng gồm các tế bào hình đa giác, hình tròn, kích

thước lớn sắp xếp lộn xộn nhau tạo thành các khoảng gian bào (3). Mô cứng gồm

các tế bào dày hóa gỗ tạo thành hình cung phía trên bó libe gỗ (4). Libe gỗ tạo thành



28



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ ngay(73 tr)

×