Tải bản đầy đủ
Ưu điểm và hạn chế.

Ưu điểm và hạn chế.

Tải bản đầy đủ

Ưu nhược điểm:


Ưu điểm:
+ Đơn giản nhất, Nhanh chóng bởi vì chỉ có một kháng thể và trải qua ít bước
hơn.
+ Phản ứng của kháng thể thứ cấp được loại bỏ.



Nhược điểm:
+ Độ đặc hiệu bị giới hạn vì thường thì kháng nguyên có ít nhất là 2 epitope (trình
diện kháng nguyên) mà phương pháp này chỉ sử dụng 1 kháng thể gắn vào một
epitope.
+ Phản ứng miễn dịch của kháng thể chính có thể ảnh hưởng bất lợi bằng cách tác
dụng với các enzyme.
+ Phải đánh dấu cho từng kháng thể chuyên biệt với từng đối tượng.
+ Không có sự linh hoạt trong lựa chọn kháng thể chính từ một thí nghiệm khác
+ Khuếch đại tín hiệu tối thiểu.

4

Áp dụng:
- Phát hiện nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh được sinh ra từ mẹ nhiễm HIV.
- Phát hiện sớm giai đoạn mới nhiễm HIV (giai đoạn cửa sổ) hoặc khi kết quả phát hiện
KT không rõ ràng.
- Theo dõi diễn tiến bệnh, đánh giá hiệu quả điều trị thuốc kháng virút và trong các mục
đích nghiên cứu khác.
2. Indirect ELISA (ELISA gián tiếp)

Phương pháp này khác Direct ELISA ở chỗ kháng thể bắt kháng nguyên không được gắn
enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng thể khác (kháng thể này mới là
kháng thể được gắn với enzyme).
Quy trình thực hiện:

- Chuyển kháng nguyên đã biết lên bề mặt cứng ( được gọi chung là các đĩa). Kháng
nguyên sẽ được cố định trên bề mặt. Nồng độ của các mẫu kháng nguyên này dùng để
thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ của kháng nguyên trong các mẫu chưa biết.
5

- Chuyển các mẫu kháng nguyên chưa biết vào các giếng khác. Kháng nguyên chưa biết
được hòa tan trong cùng một loại dung dịch đệm giống các mẫu KN chuẩn.
- Thêm dung dịch protein không tương tác (non-interacting protein) như albumin huyết
thanh bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất cả các mẫu (kể cả mẫu chuẩn). Bước
này được gọi là "blockin" do protein huyết thanh có tác dụng ngăn cản sự hấp phụ của
các protein khác lên bề mặt của đĩa.
- Rửa bề mặt đĩa sau đó chuyển kháng thể (biết trước) vào tất cả các giếng của đĩa. Kháng
thể sẽ kết hợp với các kháng nguyên đã được cố định mà không kết hợp với protein của
huyết thanh.
- Thêm kháng thể thứ cấp (secondary antibody), kháng thể thứ cấp sẽ kết hợp với bất kỳ
một kháng thể còn dư (bước này có thể được bỏ qua nếu kháng thể dùng để phát hiện
kháng nguyên đã gắn với enzyme).
- Rửa đĩa, các kháng nguyên gắn enzyme còn dư sẽ được loại bỏ.
- Thêm cơ chất. Enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh quang hay
tín hiệu điện hóa học (enzyme có tác dụng như yếu tố khuyếch đại).
Ưu nhược điểm:


Ưu điểm:
+ Bước cố định kháng nguyên không có tính đặc hiệu nên bất kỳ protein nào cũng
gắn với bề mặt đĩa vì vậy kháng thể (có nồng độ thấp) phải cạnh tranh với các
protein khác trong huyết thanh khi gắn kết với bề mặt của đĩa. Sandwich ELISA
hạn chế được nhược điểm này.
+ Kháng thể gắn enzyme có thể sử dụng để đánh dấu cho nhiều loại kháng nguyên
nên tiện lợi và kinh tế hơn, dễ dàng thương mại hóa.
+ Linh hoạt bởi vì các kháng thể nhiều chính có thể được thực hiện trong một loài
và cùng một kháng thể thứ cấp có thể được sử dụng để phát hiện.
+ Độ nhạy sáng được tăng lên bởi vì mỗi kháng thể chính chứa các epitope một số
có thể được ràng buộc bởi các kháng thể thứ cấp , cho phép khuếch đại tín hiệu.
Nhược điểm:



+ Độ đặc hiệu của từng kháng huyết thanh là khác nhau. Điều này dẫn đến kết quả
khác nhau giữa các thí nghiệm và do đó cần phải thử nghiệm với nhiều kháng
6

huyết thanh khác nhau để kết quả có thể tin tưởng được.
+ Phản ứng có thể xảy ra với kháng thể thứ cấp, dẫn đến tín hiệu không đặc hiệu.
+ Một bước ủ bệnh thêm là cần thiết trong thủ tục.
3. Sandwich ELISA

Đây là một dạng ELISA được sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do nó cho phản ứng
mạnh và nhạy. Được gọi là “sandwich” là do kết quả thí nghiệm được đánh giá thông qua
sự kết hợp của hai loại kháng thể là kháng thể bắt (capture antibodies) và kháng thể phát
hiện (detection antibodies). Kỹ thuật này cũng được phân làm hai dạng là Direct
sandwich ELISA (DAS-ELISA - Double antibody sandwich) và Indirect sandwich ELISA
(TAS-ELISA – Triple antibody sandwich).
3.1 Sandwich ELISA trực tiếp

- Ưu điểm: Có thể phát hiện sự khác biệt nhỏ giữa các kháng nguyên nếu sử dụng kháng
thể bắt và kháng thể phát hiện khác nhau.
- Vì phương pháp này có ưu điểm hơn hẳn những phương pháp khác mà chúng tôi chọn
phương pháp này để chẩn đoán bệnh virus đang nghiên cứu.

7

Chú ý: nếu sử dụng kháng thể bắt và kháng thể phát hiện giống nhau có thể dẫn đến vấn
đề nếu có sự giới hạn vị trí kết hợp sẵn có để phát hiện. Mối quan hệ về kích thước và vị
trí không gian của các epitope cũng có ảnh hưởng đến thử nghiệm.
3.2 Sandwich ELISA gián tiếp

Chuyên biệt hơn Direct sanwich ELISA do antispecies kháng thể được gắn enzyme
không phản ứng với kháng thể bắt kháng nguyên.
4. ELISA cạnh tranh

Quy trình thực hiện:
+ “Ủ” kháng thể không được đánh dấu với kháng nguyên.
+ Đưa hỗn hợp này vào các giếng của vi phiếm có chứa kháng nguyên.
+ Rửa đĩa, kháng thể không được gắn kết sẽ bị rửa trôi. Lượng kháng nguyên càng lớn,
lượng kháng thể gắn thành công với kháng nguyên trong đĩa càng thấp do “cạnh tranh”

8

+ Thêm kháng thể thứ cấp (kháng thể của kháng thể ở bước 1). Kháng thể thứ cấp gắn
với enzym.
+ Thêm cơ chất. Lượng enzym dư sẽ giải phóng tín hiệu huỳnh quang hay tín hiệu màu.
Trong phương pháp này, hàm lượng kháng nguyên gốc càng cao, tín hiệu sản sinh càng
yếu.
III.
Các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp
1. Ảnh hưởng đến độ nhạy



Số lượng kháng thể thứ nhất được gắn vào đáy giếng



Ái lực của kháng thể thứ nhất đối với kháng nguyên



Ái lực của kháng thể thứ hai đối với kháng nguyên

2. Ảnh hưởng đến kết quả

Nếu các đối chứng âm cho kết quả dương tính thì có thể do sự nhiễm từ chất tạo



màu hoặc từ kháng thể được đánh dấu hoặc chính các đối chứng bị nhiễm.
Nếu màu không xuất hiện đối với đối chứng dương hoặc đối với mẫu thì phải



kiểm tra lại tất cả hoá chất bao gồm: hạn sử dụng, nồng độ, điều kiện bảo quản
Nếu màu xuất hiện quá thấp đối với đối chứng dương và cả mẫu kiểm tra thì phải



kiểm tra lại kháng thể được gắn enzyme và nồng độ của chất tạo màu.
Nếu có tạo màu đối với mẫu nhưng không tạo màu với đối chứng dương thì có thể



kiểm tra lại nguồn gốc đối chứng, hạn sử dụng và điều kiện bảo quản.
Khi chạy lại một thử nghiệm trong điều kiện đang gặp sự cố thì chỉ nên thay đổi



một yếu tố thí nghiệm.
Một số thiết bị sử dụng trong phương pháp ELISA
Khay nhựa có các giếng.

IV.
9

Máy quang phổ với các bước sóng khác nhau.
Micropipette.
Máy rửa khay nhựa.

-

V.
Ứng dụng
1. Trong thực phẩm

-Phương pháp Elisa có thể phát hiện và định lượng vi sinh trong thực phẩm trong thời
gian vài giờ sau khi tăng sinh.
-Phát hiện yếu tố gây dị ứng thực phẩm như sữa, đậu phộng, quả óc chó, hạnh nhân và
trứng
-Phát hiện độc tố trong tảo.
-Phát hiện vi khuẩn E.coli, Salmonella, Staphylococcus aureus,sán lá gan… trong thực
phẩm.
-Phát hiện chất chloramphenicol (chất không được phép có trong tôm, cá và các sản
phẩm thuỷ sản khác)
-Kiểm tra dư lượng kháng sinh trong thực phẩm,tàn dư thuốc diệt cỏ,thuốc trừ sâu…
2. Trong nông nghiệp

-Chuẩn đoán bệnh Tristeza(tác nhân gây bệnh héo rũ) trên cây cam quýt.
-Giám định sự hiện diện của BBTV(Banana Bunchy Top Virus) gây bệnh chùn đọt chuối.
-Phát hiện kháng thể chống Mycoplasma hyopnewmonia(MH) ở heo.
-Giám định bệnh lùn xoắn lá trên lúa bằng phương pháp DAS ELISA cải tiến
3. Trong y học

-Chuẩn đóan và điều trị bệnh viêm gan siêu vi B và C,bệnh ung thư.
-Ứng dụng để phát hiện bệnh A. cantonensis (bệnh viêm màng não) do loại giun kí sinh ở
phổi chuột gây ra.
- Xác định tỉ lệ nhiễm kí sinh trùng sốt rét ở miền Trung-Tây Nguyên.
VI.
Ứng dụng của ELISA trong xét nghiệm HIV
1. Về HIV/AIDS

10