Tải bản đầy đủ - 85 (trang)
Trong khu vực nghiên cứu tại các vị trí địa hình như chân, sườn, đỉnh; hướng phơi, loài cây, tuổi cây...chúng tôi lập các ô tiêu chuẩn đại diện để điều tra, diện tích mỗi ô tiêu chuẩn là 1000 m2 (40mx25m), dung lượng mẫu điều tra đủ lớn n ( 30). Sau ...

Trong khu vực nghiên cứu tại các vị trí địa hình như chân, sườn, đỉnh; hướng phơi, loài cây, tuổi cây...chúng tôi lập các ô tiêu chuẩn đại diện để điều tra, diện tích mỗi ô tiêu chuẩn là 1000 m2 (40mx25m), dung lượng mẫu điều tra đủ lớn n ( 30). Sau ...

Tải bản đầy đủ - 85trang

15



Chụp ảnh và quan sát bằng mắt thường mô tả các Biểu hiện bên ngoài

như: màu sắc lá, tình trạnh thân, rễ.

Lấy mẫu rễ quan sát trên kính soi nổi, mô tả các triệu chứng như: thối,

loét…(nếu có)

- Phân lập trực tiếp từ rễ:

Chọn những rễ con có cả phần khỏe và phần bị bệnh, rửa bằng nước vô trùng

nhiều lần, nhúng qua các rễ con trong cồn 70%, rửa nhanh và hơ khô trên đèn

cồn. Dùng dụng cụ đã khử trùng cắt rễ thành từng miếng dài 1-2mm ở phần

ranh giới giữa mô khỏe và mô bệnh sau đó cấy lên môi trường PDA và môi

trường trường CMA (Corn Meal Agar) có kháng sinh NARPH ((Nilstat 1ml;

Ampicillin 0.1g; Rifadin 0.5ml; Terraclor (PCNB) 0.1g; Hymexazol

0.05g))/lít). [40], [41].

Đặt đĩa cấy ở nhiệt độ khoảng 25oC và quan sát hàng ngày dưới kính

lúp soi nổi để kiểm tra nấm mọc từ các miếng rễ cây.

Cấy truyền từng tản nấm lên môi trường PDA hoặc môi trường CMA.

Làm thuần nấm bằng cách cấy đỉnh sinh trưởng của sợi nấm.

- Phương pháp bẫy đất:

Đây là phương pháp chọn lọc bởi vì nó thích hợp cho việc phân lập các

loài sản sinh ra du động bào tử.

+ Cho khoảng 200g đất vào một hộp nhựa

+ Đổ nước vô trùng hoặc nước cất vào hộp đựng sao cho ngập đất khoảng

5-10cm.

+ Để lắng và vớt sạch rác nổi trên bề mặt nước

+ Thả vào hộp nhựa những lá non, tươi của cây trồng mẫn cảm với các bệnh,

các vật liệu bẫy này sẽ nổi trên mặt nước (Hình 2-1).

+ Đặt cốc nguyên vị trí trong vòng 2-4 ngày.

+ Phân lập nấm sau 1-3 ngày từ mép vết bệnh đã phát triển trên vật liệu bẫy



16



sau khi rửa trong nước vô trùng và khử trùng bề mặt, dùng môi trường

NARPH để phân lập. Đặt đĩa cấy ở nhiệt độ khoảng 25oC, cấy truyền từng tản

nấm lên môi trường PDA hoặc môi trường CMA. Làm thuần nấm bằng cách

cấy đỉnh sinh trưởng của sợi nấm.

Vật liệu có thể dùng để bẫy bao gồm lá cà ổi, lá cây có múi, lá đỗ

quyên, lá keo....



Hình 2-1: Bẫy đất

- Giám định loài nấm gây bệnh

Dựa vào đặc điểm hình thái, giải phẫu của bào tử áo (Chlamydospore),

bào tử noãn (Oogonia) và túi bào tử động (Sporangia), định loại nấm dựa trên

hai khóa phân loại nấm thuộc 2 chi Phytophthora và Pythium sau: chuyên

khảo về Phytophthora của Hamm B.P. and Hansen M.E. (1987).[47]; chuyên

khảo về Chi Pythium” của Plaats-Niterink A. J. van der (1981) [57].

Định loại nấm gây bệnh cũng được thực hiện dựa trên kỹ thuật sinh học

phân tử, cụ thể như sau:

- Tách chiết AND: Nghiền mẫu: mẫu nấm đựng trong ống ependoff 2,0ml,

cho 1 thìa hạt thủy tinh và lắc trong máy lắc từ 1 dến 2 phút; cho vào bột mẫu

vừa nghiền 400l dung dịch AP1; cho tiếp 4 l RnaseA và lắc đều trên máy



17



votex; ủ nóng dung dịch mẫu ở 650C trong 10 phút; thêm vào dung dịch mẫu

dung dịch đệm 130l AP2; ly tâm ở 14.000 vòng/phút trong 5 phút; lấy 400

l dung dịch mẫu sang ống ependoff mới; thêm 1,5 thể tích dung dụng đệm

AP3 vào ống chứa 400 l dung dịch mẫu (600 l dung dịch AP3); lấy 650 l

dung dịch mẫu vào cột lọc DNeasy Mini Spin Column, ly tâm ở 8000 vòng

phút trong 1 phút, đổ bỏ dung dịch chảy qua màng lọc, lấy tiếp dung dịch mẫu

còn lại vào cột lọc DNeasy Mini Spin Column, ly tâm ở 8000 vòng phút trong

1 phút; đặt cột lọc DNeasy Mini Spin Column vào ống ly tâm mới và lấy

500l dung dịch đệm AW đổ trên cột lọc để rửa ADN và ly tâm ở 8000 vòng

phút trong 1 phút, đổ bỏ dung dịch chảy qua màng lọc; thêm 500l dung dịch

vào cột lọc để tiếp tục rửa ADN trên màng lọc, ly tâm ở 14000 vòng phút

trong 2 phút, ADN nằm trên màng lọc của cột lọc DNeasy Mini Spin Column;

chuyển cột lọc sang ống ependoff mới, ghi ký hiệu mẫu và dùng 50 l dung

dịch đệm AE đổ vào cột lọc DNeasy Mini Spin Column, ly tâm ở 8000 vòng

phút trong 1 phút; thu ADN đã chảy từ cột lọc vào ống ependoff.

- Quy trình PCR: Hóa chất và công thức cho PCR đối với 1 ống ependoff

nhỏ: nước không ion (14l), 10x EX Taq buffer (2l), dNTP mix (2l),

primer 1- ITS1 10M (0,5l), primer 2-ITS4 10M (0,5l), EX taq (0,1l).

Tất cả các hóa chất trên được lấy 1 lượng gấp 9 lần cho vào 1 ống ependoff

với tổng số 172l gồm các thành phần sau: nước (126l), 10x EX Taq

buffer (18l), dNTP mix (18l), primer 1 (ITS1) (4,5 l) ), primer 2 (ITS4)

(4,5 l), EX taq (1l). Lấy 19 l từ ống ependoff chứa 172 l cho vào 8 ống

ependoff. Thêm 1 l ADN cần thực hiện phản ứng PCR của từng mẫu vào

từng ống. Đánh số 1 đến 8. Ống ependoff từ 1 đến 7 chứa ADN còn ống thứ 8

là đối chứng. Chạy phản ứng PCR trên máy với quy trình: bước 1: cycle 1

(1x)ở 950C trong 03.00 phút; bước 2: cycle 1 (40x) ở 950C trong 00.30phút;



18



bước 2: ở 500C trong 00.30 phút; bước 3: ở 720C trong 01.00 phút; bước 1:

Cycle 3 (1x) ở 720C trong 05.00 phút; bước 1: cycle 1 (1x) ở 150C trong 10.00

phút.

- Quy trình chạy điện di: pha bản thạch: bản thạch 1% Agarose S (1 gam

Agarose S + 99 ml TAE), đun chảy thạch, để nguội 500C đổ trên bản khuôn

đã cắm lược; để nguội thạch, rút lược và đặt khay thạch vào máy điện di đã đổ

dung dịch ATE, chiều lỗ lược quay về phía cực âm, cho 2l dung dịch đánh

dấu vào lỗ lược 1. ADN của các mẫu được lấy 1.5 l trộn vói 1 l chất nhuộm

cho vào các lỗ lược, lỗ lược thứ 8 là đối chứng không có DNA; chạy chương

trình 22 phút ở 100V, nhúng trong dung dịch dịnh hình và quan sát ADN trên

bản thạch dưới ánh sáng tử ngoại, những mẫu có ADN đủ lớn để sequencing

phải thể thiện trên bản gel.

- Đọc trình tự AND và định loại các chủng nấm: Trình tự AND được đọc

bằng phương pháp “Dideoxy Chain Termination”. Sử dụng máy đọc trình tự

model 377 của hãng Applied Biosystem. Sữa chữa chuỗi AND bằng phần

mền BioEdit. Các chuỗi AND của các mẫu nấm được so sánh với chuỗi AND

trên ngân hàng gen thông qua giao diện tìm kiếm Blast (Basic Local

Alignment Search Tool) trên website: http://ncbi.nlm.nih.gov.

2.5.3. Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vật gây bệnh

trong phòng thí nghiệm

2.5.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ sinh trưởng và phát

triển của khuẩn lạc

Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường dinh dưỡng PDA, đặt trong

tủ định ôn có các mức nhiệt độ khác nhau. Phương pháp thí nghiệm được tiến

hành như sau:



19



Đổ môi trường dinh dưỡng PDA đã nấu vào đĩa petri được khử trùng

dầy 2 – 3 mm, để nguội cho môi trường đông cứng lại, cấy giống nấm đã

được phân lập từ 10 – 12 ngày tuổi vào chính giữa hộp lồng rồi băng lại cho

kín. Xếp các hộp lồng vào tủ định ôn có nhiệt độ: 15oC± 1; 200C ± 1; 250C ±

1; 300C ± 1; 350C ± 1, mỗi tủ đặt 2 hộp lồng. Đo đường kính của khuẩn lạc

theo hai chiều vuông góc, lấy trị số trung bình và đo ở ngày thứ 3 - 6. Thí

nghiệm được lập lại 2 lần và lấy trị số bình quân làm đại diện cho thí nghiệm.

2.5.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm đến tốc độ sinh trưởng và phát

triển của khuẩn lạc

Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Both.C. Dung dịch

NaCl được pha với các nồng độ khác nhau trong bình hút ẩm tạo cho chúng

ta có được các độ ẩm như sau:

NaCl (g/lít)

RH%



0



16



32



48



64



100



90



80



70



60



Dung dịch pha xong đổ vào bình hút ẩm loại lớn, đậy nắp lại để ở

phòng thí nghiệm, trong tối có nhiệt độ không khí khoảng 23 - 270C. Sau 3

ngày trong các bình hút ẩm khác nhau sẽ có độ ẩm không khí khác nhau, phụ

thuộc vào nồng độ của NaCl, khi nồng độ của NaCl càng lớn thì độ ẩm của

môi trường càng nhỏ và ngược lại nồng độ của NaCl càng nhỏ thì độ ẩm của

môi trường càng lớn. Môi trường PDA sau khi hấp khử trùng được đổ vào

hộp lồng đã được khử trùng một lớp dày 2 - 3 mm. Cấy giống nấm đã được

phân lập từ 10 - 12 ngày tuổi vào chính giữa hộp lồng bằng que cấy.Đặt hộp

lồng vào các bình hút ẩm có độ ẩm không khí khác nhau, mỗi bình ta đặt 2

hộp. Sau 3 ngày lấy hộp lồng đo đường kính khuẩn lạc theo hai chiều vuông

góc, lấy trị số bình quân của các hộp lồng đặt trong mỗi bình hút ẩm. Thí

nghiệm được lặp lại 2 lần.



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Trong khu vực nghiên cứu tại các vị trí địa hình như chân, sườn, đỉnh; hướng phơi, loài cây, tuổi cây...chúng tôi lập các ô tiêu chuẩn đại diện để điều tra, diện tích mỗi ô tiêu chuẩn là 1000 m2 (40mx25m), dung lượng mẫu điều tra đủ lớn n ( 30). Sau ...

Tải bản đầy đủ ngay(85 tr)

×