Tải bản đầy đủ - 169 (trang)
Các kỹ thuật di truyền tế bào

Các kỹ thuật di truyền tế bào

Tải bản đầy đủ - 169trang

Các kỹ thuật chẩn đoán di truyền

Xử lý và nhuộm tế bào để quan sát NST với cấu trúc băng;

Quan sát, chụp hình, đếm, sắp xếp và phân tích.

Thông tin từ kết quả

Nhiễm sắc thể đồ cho phép chúng ta khảo sát tổng quát toàn bộ bộ NST, phát hiện

các bất thường số lượng NST, các bất thường cấu trúc như chuyển đoạn, đảo đoạn,

NST đều, các mất đoạn và nhân đoạn lớn (thông thường trên 2 Mb).

Hạn chế

Không thể đem lại thông tin về các bất thường cấu trúc nhỏ hơn 2 Mb, các

bất thường về mythyl hóa (trường hợp dấu ấn di truyền), các bệnh lý gien...

Thời gian thực hiện xét nghiệm dài.

Có thể thất bại trong nuôi cấy.

Có khả năng nhiễm tế bào mẹ gây sai lệch chẩn đoán.

Đây là xét nghiệm di truyền cơ bản và quan trọng, sẽ được trình bày chi tiết trong

phần II .

b. Lai huỳnh quang tại chỗ: FISH (Fluorescence in situ hybridization)

Nguyên lý

Dựa trên sự bắt cặp giữa các base bổ sung, một đoạn DNA có thể được tổng hợp và

đánh dấu huỳnh quang (gọi là đoạn mồi), trước khi cho tiếp xúc với NST cần khảo

sát. Trong những điều kiện thích hợp, đoạn mồi sẽ bắt cặp với vùng tương ứng trên

NST cần khảo sát (gọi là phản ứng lai).

Tín hiệu huỳnh quang sẽ được quan sát nhằm xác định tình trạng:

bình thường (có 2 tín hiệu huỳnh quang, tương ứng với vùng cần khảo sát

trên 2 NST ;

mất đoạn: mất 1 hay 2 tín hiệu, hoặc có trường hợp chỉ giảm cường độ tín

hiệu (khi mất đoạn nhỏ hơn kích thước đoạn mồi). Trường hợp monosomy,

cũng quan sát thấy mất một tín hiệu;

nhân đoạn: có tín hiệu thứ 3, thứ 4... Trường hợp trisomy cũng quan sát thấy

3 tín hiệu;

chuyển đoạn: tín hiệu được phát hiện trên một NST khác.

Vùng cần khảo sát được xác định dựa vào:

những triệu chứng lâm sàng hướng chẩn đoán đến một bệnh lý mà bất

thường trên NST đã được mô tả rõ;

bất thường cấu trúc (mất đoạn, nhân đoạn, đảo đoạn, chuyển đoạn, NST đều)

được quan sát thấy trên NST đồ nhưng cần được khẳng định lại.

106



Các kỹ thuật chẩn đoán di truyền

Phương pháp

Theo nguyên lý trên, việc thực hiện kỹ thuật FISH gồm các bước:

Tổng hợp đoạn mồi tương ứng với vùng cần khảo sát;

Đánh dấu huỳnh quang đoạn mồi (có thể đánh dấu bằng nhiều màu huỳnh

quang trong trường hợp lai cùng lúc nhiều loại mồi khác nhau);

Thực hiện phản ứng lai;

Rửa đi các đoạn mồi thừa không gắn vào vùng cần khảo sát, cố định tiêu

bản, quan sát, chụp hình, phân tích.

Thông tin từ kết quả

Khi đã có được hình chụp các cụm NST kỳ giữa lai với đoạn mồi, công việc còn lại

chỉ là đếm số lượng các tín hiệu nhằm xác định các chẩn đoán mất đoạn, nhân

đoạn, trisomy, monosomy. Vị trí tương đối của các tín hiệu có màu huỳnh quang

khác nhau (ví dụ: đoạn mồi đặc hiệu màu đỏ, đoạn mồi cho các telomere màu xanh)

có thể khẳng định các chẩn đoán chuyển đoạn, đảo đoạn.

Hạn chế

Chỉ đem lại thông tin liên quan đến vùng cần khảo sát.

Chỉ có thể phát hiện các mất đoạn, nhân đoạn lớn hơn 10 Kb.

c. Nhuộm toàn bộ NST (Chromosome painting)

Nguyên lý

Cùng nguyên lý với kỹ thuật FISH, nhưng sử dụng nhiều đoạn mồi lai trên suốt

chiều dài của một NST.

Phương pháp

Tương tự nhưkỹ thuật FISH.

Thông tin từ kết quả

Với toàn bộ NST phát huỳnh quang, các chuyển đoạn được quan sát rõ ràng, cũng

như các trường hợp một đoạn NST chènvào giữa NST khác.

Kỹ thuật này đặc biệt hữu ích trong các trường hợp chuyển đoạn không rõđiểm gãy

(do đó không chọn được đoạn mồi đặc hiệu như trong kỹ thuật FISH).

Hạn chế

Giá thành khá cao và thông tin thu được hạn chế (không phát hiện được đảo đoạn,

mất đoạn...)

107



Các kỹ thuật chẩn đoán di truyền

d. NST đồ quang phổ (spectral karyotype)

Nguyên lý

Cùng nguyên lý với kỹ thuật FISH và kỹ thuật Nhuộm toàn bộ NST, nhưng sử dụng

các bộ mồi nhuộm khác màu huỳnh quang cho mỗi NST khác nhau.

Phương pháp

Tương tự như kỹ thuật FISH.

Thông tin từ kết quả

Phát hiện chuyển đoạn, chèn đoạn tương tự như kỹ thuật Nhuộm toàn bộ NST.

Đặc biệt kỹ thuật NST đồ quang phổgiúp nhận ra nhanh chóng nguồn gốc của NST

marker, giúp khảo sát các trường hợp bất thường cấu trúc NST phức tạp, liên quan

đến nhiều cặp NST khác nhau (ví dụ: trong các bệnh máu ác tính).

Hạn chế

Giá thành rất cao.



3. Các kỹ thuật di truyền phân tử

a. Phản ứng PCR (polymerase chain reaction)

Nguyên lý

Xuất phát từ cơ chế tự sao của DNA trong tự nhiên.

Khi các điều kiện cần thiết được xây dựng lại trong môi trường thí nghiệm, DNA

của bệnh nhân có thể được phóng đại nhiều lần để phục vụ cho chẩn đoán và cho

các nhu cầu nghiên cứu khác.

Các điều kiện cần thiết bao gồm:

Sự tách rời của hai mạch DNA gốc;

Đoạn mồi;

Sự tổng hợp mạch DNA mới bởi enzyme.

Phương pháp

Chuẩn bị các đoạn mồi (primer) tương ứng với vùng DNA cần được phóng

đại;

Tách rời hai mạch DNA gốc bởi nhiệt (denaturation) (95 - 98°C);

Hạ nhiệt độ vừa đủ nhằm cho phép các đoạn mồi gắn được vào đoạn có trình

tự đặc hiệu tương ứng trên mạch gốc (50 - 65°C);

108



Các kỹ thuật chẩn đoán di truyền

Tổng hợp mạch DNA mới bởi enzyme polymerase bền nhiệt,

Lập lại chu trình nhiều lần.

Vì quá trình tách 2 mạch DNA gốc được thực hiện bởi nhiệt, enzyme sử dụng phải

bền với nhiệt độ cao. Taq polymerase, một enzyme phân lập từ loại vi khuẩn

Thermus aquaticus, có thể trải qua nhiệt độ 98°C trong 25 - 35 chu kỳ mà vẫn giữ

khả năng hoạt động.

Sản phẩm PCR sau đó sẽ được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di (định tính: có sản

phẩm phóng đại hoặc không). Sản phẩm có thể được tinh sạch trước khi sử dụng

cho các kỹ thuật khác.

Cũng dựa trên nguyên lý và kỹ thuật căn bản trên, có thể bổ sung một số bước kỹ

thuật nhằm định lượng sản phẩm PCR (sử dụng các đoạn mồi đánh dấu huỳnh

quang, so sánh với một chứng nội tại). Kỹ thuật này gọi là PCR định lượng

(quantitative PCR).

Kỹ thuật PCR có nhiều ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu và chuẩn đoán.

Thông tin từ kết quả

Thông tin định tính: Có hay không có sự phóng đại đoạn DNA đích.

Thông tin định lượng: So sánh giữa lượng sản phẩm của đoạn DNA đích và của

đoạn DNA chứng (là đoạn DNA bình thường, hiện diện 2 phiên bản trong bộ NST).

Ta có các trường hợp:

Sản phẩm của DNA đích = sản phẩm của DNA chứng nội tại. Kết luận đoạn

DNA đích hiện diện 2 phiên bản trong bộ NST: bình thường.

Sản phẩm của DNA đích = 1/2 sản phẩm của DNA chứng nội tại. Kết luận

đoạn DNA đích hiện diện 1 phiên bản trong bộ NST: mất đoạn, hoặc

monosomy chiếc NST tương ứng.

Sản phẩm của DNA đích = 3/2 sản phẩm của DNA chứng nội tại. Kết luận

đoạn DNA đích hiện diện 3 phiên bản trong bộ NST: nhân đoạn, hoặc

trisomy chiếc NST tương ứng.

Hạn chế

Đoạn mồi PCR cần được tổng hợp đặc hiệu, nên chỉ thực hiện được phản ứng PCR

cho những đoạn DNA đích đã được biết rõ trình tự.

Độ dài các đoạn DNA có thể được phóng đại bằng phản ứng PCR có giới hạn (hiệu

quả nhất là khoảng vài trăm pb đến vài Kb, dài nhất khoảng 20 Kb). Do đó, đây là

kỹ thuật khảo sát rất đặc hiệu và phổ khảo sát hẹp.

109



Tài liệu bạn tìm kiếm đã sẵn sàng tải về

Các kỹ thuật di truyền tế bào

Tải bản đầy đủ ngay(169 tr)

×