Tải bản đầy đủ
B. HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI ĐỂ LẬP CÔNG THỨC MÁU

B. HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI ĐỂ LẬP CÔNG THỨC MÁU

Tải bản đầy đủ

 Ống trộn
Ống trộn là dụng cụ dùng để pha loãng máu dùng đếm hồng cầu, bạch cầu và
tiểu cầu. Ống trộn là một ống mao quản có chỗ bầu phình ra, trong bầu có hạt thủy
tinh và có màu để trộn đều máu với dung dịch trộn ( ở ống trộn hồng cầu bao giờ
cũng có hạt màu đổ, còn ống trọn bạch cầu hạt này có màu trắng hoặc xanh nhưng
không bao giờ có hạt màu đỏ). Ở ống mao quản có vạch 0.5 và 1. Phần trên chỗ
phình có vạch 101 ở ống trộn hồng cầu hoặc vạch 101 thì thể tích máu trộn với
dung dịch là ở trong phần bầu phình(100 phần, trong đó có một phần máu), từ vạch
1 trở xuống chỉ có dung dịch chứ không có máu. Máu đã được pha loãng 100 lần.
Nếu chỉ hút đến vạch 0.5 thì máu được pha loãng 200 lần vì lượng máu chỉ bằng
nửa lượng máu trên. Ta cũng suy luận như vậy đối ống trộn bạch cầu: có thể pha
loãng máu ở 10 lần 20 lần tùy theo ý muốn.

Ống trộn bạch cầu, hồng cầu
 Phòng đếm
Phòng đếm giống như một lam kính dày có khắc 4 rãnh sâu làm chỗ thoát dung
dịch, không cho nó tràn lên bờ bên ( là bờ dán lá kính). Bờ giữa thấp hơn bờ bên 0,1
mm ( chính xác tới 0,001mm). Vì vậy, để đảm bảo độ cao này cần phải dán chặt lá
kính lên hai bờ bên. (Hình )
Ở bờ giữa có khắc một hoặc hai lưới đếm ( cách nhau bằng 1 rãnh ngang). Phòng
đếm là những vạch kẻ ngang trên bờ giữa theo một kích thước nhất định. Có nhiều
62

cách kẻ lưới đếm để bố trí các ô đếm khác nhau tùy từng tác giả. Trong lưới đều có
các ô vuông lớn và các ô vuông nhỏ. Tùy lưới đếm có thể bố trí khác nhau nhưng
kích thước một ô vuông nhỏ bao giờ cũng là 1/400 mm2 ( Hình )
Biết được diện tích đếm, chiều cao của ô đếm (0,1mm) và số ô đếm, ta suy ra được
thể tích trộn nằm trong vùng đã đếm và biết được độ pha loãng của máu thì ta tính
được số lượng tế bào máu trong có trong 1mm 3 máu chưa pha loãng. Khi dùng
phòng đếm và ống trộn phải chú ý:
-

Không được làm xây xước ( dùng gạc mềm sạch để lau, rửa bằng

-

ete,cồn, ngầm vào acid sulfocromic, không dùng que cứng chọc).
Không được để máu đông bám đọng ở ống trộn, phòng đếm.

Phòng đếm

Lưới đếm Goriaev

63

Lưới đếm Neubauer

Đếm số lượng hồng cầu
 Nguyên tắc
Pha loãng máu theo một tỷ lệ nhất định rồi cho vào phòng đếm đã biết rõ kích
thước. Đếm số lượng hồng cầu dưới kính hiển vi với số ô nhật định, từ đó tính ra số
lượng hồng cầu trong 1mm3 máy chưa pha loãng.
 Phương tiện cần thiết
 Bộ dụng cụ để chích máu: Bông, cồn 700 , kim chích máu.
 Phòng đếm huyết cầu Neubauer cải tiến.
 Ống trộn hồng cầu
 Kính hiển vi vật kính 8 và 40, thị kính 10 hoặc 15.
 Dung dịch pha loãng máu: dung dịch nước muối đẳng trương hay dung dịch
Marcano hoặc dung dịch Hayem.
Cách làm:
Chuẩn bị phòng đếm
64

Dùng khăn sạch và mềm lau phòng đếm và lá kính
Dán lá kính lên phòng đếm
Đặt phòng đếm lên kính hiển vi để kiểm tra phòng đếm, quan sát toàn cảnh
phòng đếm và xác định vị trí đếm hồng cầu (là 5 ô vuông lớn có chia thành ô
vuông nhỏ, 4 ô ở bốn góc và một ô giữa khu vực đếm hồng cầu.)
Sát trùng chích máu
Người lớn lấy ở đầu ngón tay đeo nhẫn, trẻ em lấy ở đầu ngón tay cái, ngón
chân cái hoặc ở gót chân. Lấy máu vào buổi sáng, chưa ăn, nghỉ ngơi ít nhất 15
phút sau khi lấy máu.
Dùng bông tẩm cồn 700 sát trùng nơi chích máu, để khô. Dùng kim đã tiệt trùng
chích sâu độ 1 đến 1,5 mm. Lau bỏ giọt đầu tiên. Để giọt máu tiếp theo chảy ra
thật tròn, đường kính khoảng 2mm. Chú ý không nên bỏ năn vì như vậy dịch kẻ
chảy ra hòa lẫn với máu làm sai lệch kết quả.
Pha loãng máu
Hút máu vào ống trộn hồng cầu đúng đến vạch 0.5 rồi dùng bông kho lau sạch
máu dính ở đầu ống. Hút tiếp dung dịch pha loãng hồng cầu đến vạch 101. Như
vậy tỷ lệ pha loãng sẽ là 1/200. Chú ý tránh hút mạnh vì sẽ có bọt. Dùng ngón
tay cái ngón tay trỏ bị kín hay đầu ống, lắc vài phút để máu và dụng dịch trộn
đều.
Cho máu vào phòng đếm
Lắc ống trộn thật đều, bỏ vài giọt đầu là những giọt nằm ở phần mao quản ống
trộn không có màu.
Nghiêng ống trộn đặt vào nơi tiếp xúc giữa lá kinh và phòng đếm cho đến khi
máu phủ vừa hết phòng đếm, nếu rỏ quá nhiều là kính sẽ nổi lên, chiều cao
buồn đếm tăng gây sai số.
Cách đếm
Sau khi cho máu vào phòng đếm, chờ vài phút để hồng cầu lắng xuống ổn
định. Dùng một vật kính 8 hoặc 10 kiểm tra xem máu đã dàn đều chưa, xác
định các ô cần đếm rồi dùng vật kính 40 để đếm. Đếm số hồng cầu có trong 80
ô vuông nhỏ ở 5 ô vuông lớn. Mỗi ô vuông lớn ( mỗi ô chia làm 16 ô vuông
65

nhỏ) 4 ô ở góc và một ô ở giữa. Đếm số lượng hồng cầu nằm gọn trong các ô
vuông nhỏ, Với những hồng cầu nằm trên các cạnh thì chỉ đếm trên 2 cạnh
liên tiếp. Ví dụ cạnh trên với cạnh trái hoặc cạnh dưới với cạnh phải
Cách tính kết quả
Giả sử hồng cầu ta đếm được trong 80 ô nhỏ là A. Thể tích mỗi ô vuông là
1/400 mm3 , tỷ lệ pha loãng máu là 1/200. Như vậy số lượng hồng cầu trong
một mm3 là (N) là:
N=
Nói một cách khác, sau khi đếm trên 80 ô vuông nhỏ được A hồng cầu ta chỉ
việc thêm vào bốn số 0 thì được số lượng hồng cầu trong 1mm 3 máu. Từ đó
tính ra được số lượng hồng cầu có trong 1 lít máu.
Ghi chú: Đối với những bệnh nhân bị thiếu máu nặng thì hút đếm đến vạch 1
và hút tiếp dụng dịch pha loãng 101. Như vậy tỷ lệ pha loãng là 1/100, kết quả
là A*5000
Nhận định kết quả:
Số lượng hồng cầu của người Việt nam trưởng thành bình thường là:
Nam : 4,5-5,4 .1012 /lit máu
Nữ: 3,8-4,8 .1012/lit máu.
Đếm số lượng bạch cầu:
1. Nguyên tắc
Pha loãng máu theo một tỷ lệ nhất định bằng dung dịch có tác dụng phá hủy
hồng cầu và nhuộm sơ bộ bạch cầu vào phòng dếm đã biết rõ kích thước. Đếm
số bạch cầu dưới kính hiển vi trong một số ô nhất định rồi tính ra số lượng
bạch cầu trong một mm3 máu chưa pha loãng.
2.





3.

Phương tiện cần thiết
Bộ dụng cụ để chích máu
Phòng đếm Neubauer cải tiến
Ống trộn bạch cầu
Kính hiển vi
Dung dịch pha loãng máu: Dung dịch laxarua
Cách làm
66

1. Chuẩn bị phòng đếm
Lau sạch phòng đếm và lá kính dán lá kính lên phòng đếm, kiểm tra phòng
đếm dưới kính hiển vi.
2. Sát trùng, chích máu: làm tương tự với đếm hồng cầu
3. Pha loãng máu
Hút máu vào ống trộn bạch cầu tới vạch 0.5;hút tiếp dung dịch Lazarus tới
vạch 11, Như vậy tỷ lệ pha loãng là 1/20. Dùng ngón cái và ngón tay trỏ bịt
chặt hai đầu ống,lắc trộn đều trong vài phút, để yên 5 phút để phá hồng cầu và
nhuộm sơ bộ bạch cầu.
4. Cho máu vào phòng đếm
Lắc ống trộn, bỏ vài giọt đầu rồi cho máu vào phòng đếm đã được dãn sẵn lá
kính như hồng cầu.
5. Cách đếm
Dùng vật kính 8 hay 10 thị kính 15 để đếm bạch cầu trong 4 khu vực mỗi khu
vực gồm 16 ô lớn. Không chia các ô nhỏ. Chúng ta sẽ đếm số bạch cầu trong
64 ô vuông lớn. Diện tích của một ô vuông lớn là 1/16 mm3 vì thể tích của nó
là 1.160 mm3 ( gấp 25 lần một ô vuông nhỏ)
6. Cách tính kết quả
Giả sử tổng số lượng bạch cầu đếm là A thì số lượng bạch cầu trong 1 mm 3 là
(N)
N=
Từ đó tính ra số lượng bạch cầu có trong 1 lít máu
7. Nhận định kết quả
Số lượng bạch cầu của người Việt Nam trưởng thành bình thường là
5*109 – 8 *109 /lít máu
Nếu dưới 4. 109/lit là số lượng bạch cầu giảm, trên 9 *109 là tăng số lượng
bạch cầu.
Nhận định công thức bạch cầu phổ thông
1. Nguyên tắc

67

Trên tiêu bản máu ngoại vi đã đươc dàn mỏng và nhuộm, dựa vào hình dáng,
kích thước và sự bắt màu của nhân và các hạt trong bào tương và nhận loại
2.





vừa đếm ít nhất trong 100 bạch cầu để xác định công thức bạch cầu phổ thông.
Phương tiện
Phiến kính khô và sạch
Lá kính
Máy lập công thức bạch cầu
Thuốc để cố định và nhuộm tiêu bản
+ Dung dịch Giemsa gồm:
Giemsa
7.6g
Cồn methlic
750ml
Glycerine

250ml

+ Nước cất trung tính



3.


Dầu Cedre ( dầu bả hương)
Xelenen
Kính hiển vi ( vật kính 90 hoặc 100)
Cách làm
Kéo tiêu bản
Chích máu đầu ngón tay bỏ giọt mấu đầu lấy một giọt máu vừa phải chấm lên
phiến kiến, dùng lá kính đặt lên giọt máu thành một gốc 30 0 đến 450, chờ cho
máu dàn khắp cạnh rồi từ từ đẩy ngược cho đều tay. Nếu đẩy nhanh thì tiêu
bản sẽ mỏng, đẩy chậm quá thiêu tiêu bản sẽ dầy, khố đọc. Để khô tự nhiên rồi

cố định bằng cồn tuyệt đối.
• Nhuộm tiêu bản
Pha loãng 2 ml dung dịch Giemsa vào 18 ml nước cất, lắc trộn đều rồi nhỏ
khắc tiêu bản, để từ 15-20 phút, rửa sạch dưới vòi nước cất, hong khô rồi định
công thức.
• Định công thức bạch cầu
Nhỏ một giọt dầu cedre vào phần đuôi của tiêu bản, dùng vật kính dầu (vật
kính 90) để nhận dạng và đếm các loại bạch cầu,
+ Bạch cầu hạt trung tính: Đường kính 10-15µm, nhân chưa chia múi( nhân
hình quê) hoặc chia nhiều múi tùy theo sự trưởng thành của tế bào. Bào tương
có nhiều hạt rất nhỏ, mịn, đều nhau bắt màu hồng tím.
+ Bạch cầu hạt ưa acid: nhân chia hai múi như hình mắt kính, bào tương có
những hạt to, tròn đều bắt màu da cam.
68

+ Bạch cầu hạt ưa kiềm: nhân hình hoa thị, bào tương có những hạt to, nhỏ
không đều nhau, nằm để cả lên nhân bắt màu xanh đen.
+ Bạch cầu Lympho: Nhân to, tròn chiếm gần hết bào tương, bào tương chỉ
còn là một dải màu xanh lơ bao quanh nhân, không có hạt.
+ Bạch cầu mono: Đường kính 20-25 µm, nhân to, màu tím đen, hình dạng
nhân thay đổim thường là hình hạt đậu nằm lệch về một phía hoặc hình quả
phật thủ. Bào tương màu tro bẩn, người ta thường ví với màu da trời lúc có
cơn mưa, có những hạt bắt màu azua tập trung thành từng đám.
Cách đếm bạch cầu: đếm ở đuôi tiêu bản, đếm theo hình chữa chi và đếm ít
nhất 100 bạch cầu.
• Nhận định kết quả:
Công thức bạch cầu thông thường của người Việt Nam trưởng thành như sau:
Bạch cầu hạt trung tính:
60-70%
Bạch cầu hạt ưa acid :1-4%
Bạch cầu hạt ưa bazơ:
0-0,5%
Bạch cầu mono:
Bạch cầu lympho :

1-2%
20-30%

Đếm số lượng tiểu cầu theo phương pháp FONIO:
Nguyên tắc: Trên tiêu bản máu nhuộn, đếm số lượng tiểu cầu có trong 1000
hồng cầu rồi căn cứ vào số lượng hồng cầu có trong 1 mm 3 máu để tính ra số
lượng tiểu cầu trong 1 mm3 máu
Phương tiện cần thiết:





Bộ dụng cụ để chích máu
Phiến kính dán máu và kéo máu
Dung dịch MgS04, 14%
Dung dịch nhuộn Giemsa
Cách làm :
1. Sát trung nhón tay đeo nhẫn để khô
2. Nhỏ một giọt MgS04 14% lên chỗ vừa sát trung
3. Dùng kim chích qua giọt MgS04, để máu chả tự nhiên hòa với dung dịch, lấy
máu này làm tiêu bản để định lượng số tiểu cầu
69

4. Các đếm và tính kết quả
Tiểu cầu trên tiêu bản nhuộn Giesa màu đổ tím đường kính 2-4 µm, đứng rời
rạc xen kẽ với hồng cầu. Dùng vật kính 40 để xem lướt qua tiêu bản một lượt
rồi chọn chỗ nào hồng cầu và tiểu cầu rải đều để đếm bằng vật kính.
Đếm xem trong 1000 hồng cầu có bao nhiêu tiểu cầu và căn cứ vào số lượng
hồng cầu trong 1mm3 mà suy ra số lượng tiểu cầu trong 1 mm3 máu.
Thí dụ: Ta đếm được 40 tiểu cầu trong 1000 hồng cầu: số lượng hồng cầu của
người đó là 4.000.000/mm3 thì số lượng tiểu cầu trong 1 mm3 (N) sẽ là:
N== 160.000/ mm3
Đếm số lượng tiểu cầu theo phương pháp FIESSLY:
1. Nguyên tắc
Pha loãng máu theo một tỷ lệ nhất định bằng dùng dịch đếm tiểu cầu rồi cho
vào phòng đếm để biết rõ kích thước, đếm số lượng tiểu cầu trong một số ô
nhất định, từ đó tính ra số lượng tiểu cầu trong 1 mm3 máu chưa pha loãng.
2.





Phương tiện cần thiết
Bộ dụng cụ để chích máu
Phòng đếm huyết cầu Neubauer cải tiến
Ống trộn bạch cầu
Kính hiển vi, tốt nhất là kính hiển vi đối pha. Nếu là kính hiển vi quang học thì


3.
1.
2.
3.

phải sáng.
Dung dịch tiểu cầu
Cách làm
Chuẩn bị dụng cụ: như đếm bạch cầu
Sát trùng, chích máu: như đếm bạch cầu nhưng không bỏ giọt máu đầu
Pha loãng máu: hút máu vào ống trộn bạch cầu đến vạch 0,5 hút tiếp dung
dịch pha loãng máu đến vạch 11, lắc đến để yên 15-30 phút để phá hồng cầu

và nhuộm tiểu cầu.
4. Cho máu vào phòng đếm: như đếm bạch cầu
5. Cách đồ: Tiểu càu như những hạt nhỏ bóng, màu xanh nhạt, nhìn kỹ sẽ thấy
tiểu cầu có di động nhẹ. Dùng vật kính 40 đếm số tiểu cầu trong 80 ô vuông
nhỏ ( giống như đếm hồng cầu)
6. Cách tính: Giả sử đếm được A tiểu cầu trong 80 ô vuông nhỏ số lượng tiểu cầu
trong 1 mm3 máu (N) sẽ là:
N= = A*1000
70

Như vậy, số lượng tiểu cầu đếm được trên 80 ô vuông nhỏ và thêm vào 3 số
không ta sẽ có số lượng tiểu cầu trong 1 mm 3 máu là từ 150.000 đến 300.000.
Dưới 150.000 là giảm; trên 350.000 là tăng số lượng tiểu cầu.
Chú ý: Muốn cho xét nghiệm thật chính xác, nên đếm cả 2 phương pháp rồi
lấy số trung bình cộng. Nếu muốn đánh giá tiểu cầu về mặt chất lượng thì phải
làm các xét nghiệm về mặt chất lượng thì khi làm các xét nghiệm về độ tập
trung, hình thể, kích thước, cấu trúc phải quan sát ở tiêu bản thường không có
MgS04.
Đếm hồng cầu mạng lưới
-Nguyên tắc: Nhuộm hồng cầu mạng lưới bằng phương pháp nhuộm sống,
sau đó đếm số lượng trên 1000 hồng cầu và tính tỷ lệ phần trăm
- Phương tiện:
+ Bộ dụng cụ để chích máu
+ Phiến kính làm tiêu bản
+ Kính hiển vi
+ Dung dịch nhuộm xanh cresyl:
• Xanh cresul anh 1g
• Cồn tuyệt đối 100ml
Cách làm:
1. Làm tiêu bản
Nhỏ một giọt xanh cresyl lên lam kính sạch và dàn đều như tiêu bản công thức
bạch cầu. Như vậy trên mặt lam kính có một lớp thuốc nhuộm mỏng, để khô
tự nhiên rồi đánh dấu ở mặt có thuốc.
Chích máu rồi nhỏ một giọt máu lên lam kính đã dàn sẵn xanh cresyl rồi dàn
dần máu để lên lớp thuốc để khô tự nhiên. Cố định bằng cồn tuyệt đối rồi đem
nhuộm Giemsa.
Sau khi nhuộm, hồng cầu lưới là những hồng cầu có hạt nhỏ hoặc những mạng
màu xanh thẫm, phân bố trên mặt hồng cầu, số hạt này nhiều hay ít tùy theo
mức độ thưởng thành tế bào.
2. Cách đếm và tính kết quả
Đếm số lượng hồng cầu lưới gặp trên 1000 hồng cầu rồi tính tỷ lệ phần trăm.

71

Thí dụ: Ta đếm 1000 hồng cầu gặp 10 hồng cầu lưới thì tỷ lệ hồng cầu lưới là
1%
3. Nhận định kết quả: Bình thường tỷ lệ hồng cầu lưới ở máu ngoại vị là:
Nam: 0,7 ±0,21%
Nữ: 0,9 ±0,25%

72