Tải bản đầy đủ
Hỡnh 2.27: S c ch hot ng ca viờn gen

Hỡnh 2.27: S c ch hot ng ca viờn gen

Tải bản đầy đủ

93

Ti liu tham kho chớnh
Makrides SC. 2003. Gene Transfer and Expression in
Mammalian Cells. Elsevier Science B. V. USA.
Louis-Marie H. 2003. Animal Transgenesis and Cloning.
John Wiley and Sons, Ltd. USA.
Glick BR., Jackj P. 1994. Molecular Biotechnology. ASM
Press. Washington D.C. USA.
Chopra VL., Anwan N. 1990. Genetic Engineering and
Biotechnology. Oxford and IBH Publishing CO.PVT, Ltd. UK.
John D, Roderick S, Philip A, Richard W. 1988. Plant
Genetics Transformation and Gene Expression (A Laboratory
Manual). Blackwell Scientific Publications. UK.

94

Chng 3

Cỏc phng phỏp xỏc nh s hin din
v biu hin ca gen ngoi lai
I. Southern blot
Southern blot l mt trong nhng phng phỏp trung tõm ca
Sinh hc phõn t. Nú cũn cú tờn gi khỏc l Southern blotting,
phng phỏp lai Southern hay phng phỏp lai DNA .
Nguyờn tc ca Southern blot l mng lai nitrocellulose cú kh
nng tip nhn DNA ó c bit t lõu v ó c s dng trong
cỏc nghiờn cu lai axit nucleic khỏc nhau vo nhng thp niờn 1950
v 1960. Vo thi k ny DNA c nh khụng c phõn on, ch
n gin bao gm DNA tng s c gn trờn mng lai
nitrocellulose. S ra i ca phng phỏp in di trờn gel vo u
thp niờn 1970 ó cho phộp cỏc on DNA c ct bi enzyme hn
ch cú th c phõn tỏch da trờn c s kớch thc ca chỳng. T
ú bc phỏt trin tip theo ca phng phỏp l chuyn cỏc on
DNA phõn tỏch t gel lờn mng lai nitrocellulose. Phng phỏp ny
c E. M. Southern mụ t ti éi hc Edingburgh vo nm 1975.
Phng phỏp Southern blot n gin v hiu qu. Mc dự ó c
ci tin nhng phng phỏp ang c s dng nhiu phũng thớ
nghim sinh hc phõn t sai khỏc khụng ỏng k so vi phng
phỏp ban u.
Southern blot bao gm cỏc bc c bn sau:
Ct DNA bng enzyme hn ch thớch hp.
éin di sn phm ct trờn gel agarose.
Lm bin tớnh DNA (thụng thng khi nú cũn trờn
gel): vớ d cú th nhỳng nú vo trong dung dch NaOH 0.5M, DNA
si kộp s c tỏch thnh DNA si n. Ch DNA si n mi cú
th chuyn lờn mng lai.

95

Chuyn DNA ó bin tớnh lờn mng lai. Thụng thng
mng lai c s dng l mng nitrocellulose. Ngi ta cng cú th
s dng mng nylon. Mng nitrocellulose in hỡnh cú kh nng tip
nhn 100àg DNA/cm2, trong khi mng nylon cú kh nng tip nhn
500àg DNA/cm2. Mt khỏc mng nylon cú kh nng gi DNA chc
hn v ớt t góy hn. Vic chuyn DNA thng c tin hnh
bng hot tớnh mao dn trong khong vi ting hoc cú th dựng mt
thit b thm chõn khụng. Nu dựng thit b thm chõn khụng thỡ s
nhanh hn, ch mt khong mt ting. Trong quỏ trỡnh chuyn, v trớ
cỏc on DNA vn c gi nguyờn khụng thay i.
Lai DNA ó c c nh trờn mng vi mu dũ
(probe) DNA cú ỏnh du. Quỏ trỡnh ny da trờn nguyờn tc b
sung (gia DNA trờn mng lai vi mu dũ). é ỏnh du ngi ta
thng s dng P32, biotin/streptavidin hoc mt mu dũ phỏt quang
sinh hc.
énh v cỏc phõn t lai DNA-mu dũ. Nu s dng
mu dũ ỏnh du phúng x thỡ dựng phng phỏp phúng x t ghi
(autoradiograph) xỏc nh, nu s dng biotin/streptavidin thỡ
dựng phng phỏp so mu hoc nu s dng mu dũ phỏt quang
sinh hc thỡ phỏt hin bng s phỏt quang.
Phng phỏp Southern blot c thit k xỏc nh s hin
din, kớch thc, s lng bn sao, tớnh ng dng ca DNA trong
mt phc hp. Vớ d, Southern blot cú th c s dng phỏt
hin mt gen c bit trong mt genome nguyờn vn.

II. Northern blot
Sau khi E. M. Southern mụ t phng phỏp Southern blot vo
nm 1975, ngi ta ó dựng mt phng phỏp tng t xỏc nh
cỏc on RNA c bit gi l Northern blot. Phng phỏp ny cũn
c gi l Northern blotting, phng phỏp lai Northern hay phng
phỏp lai RNA.
Northern blot bao gm cỏc bc c bn sau:
RNA (RNA tng s hoc ch mRNA) c phõn tỏch
bng in di trờn gel agarose.

96

Hỗnh 3.1: Sồ õọử mọ taớ phổồng phaùp Southern
blot

RNA sau khi ó phõn tỏch c chuyn lờn mng lai
(cỏc phõn t RNA gi nguyờn v trớ nh trờn gel).
RNA c nh trờn mng c lai vi mu dũ DNA si
n (hoc RNA) cú ỏnh du phúng x hoc c gn vi mt

97

enzyme (alkalin phosphatase hoc horseradish peroxidase) to thnh
phõn t lai RNA-DNA (hoc RNA-RNA) si kộp.

Hỡnh 3.2: S mụ t phng phỏp Northern blot

V trớ ca mu dũ c phỏt hin nh k thut phúng
x t ghi nu nú c ỏnh du phúng x. Trong trng hp mu dũ
c gn vi enzyme thỡ em vi mt c cht khụng mu. Enzyme
liờn kt vi nú s bin i thnh mt sn phm mu cú th nhỡn thy