Tải bản đầy đủ
Hỡnh 2.24: Chuyn gen vo tinh trựng

Hỡnh 2.24: Chuyn gen vo tinh trựng

Tải bản đầy đủ

88

tinh trùng mất khả năng thụ tinh cho trứng. Tiêm trực tiếp tinh trùng
vào trứng (intra-cytoplasmic sperm ịnjection=ICSI) được sử dụng
đối với sự thụ tinh in vitro ở người. Phương pháp này đã được áp
dụng cho Xeponus và đã tạo ra Xeponus chuyển gen với kết quả có
thể chấp nhận (Hình 2.12B). Ðặc biệt hiện nay các nhà sinh học đã
ứng dụng chuyển gen vào loài này để nghiên cứu sự phát triển
(Marrsh-Arrmstrong, 1999; Perrny, 2001).
Phương pháp này, trước tiên được sử dụng cho Xeponus, đã
chứng tỏ thành công ở chuột. Tuy nhiên nó không cho kết quả cao
hơn phương pháp vi tiêm vào tiền nhân là một phương pháp đơn
giản hơn nhiều. Phương pháp ISCI đã được sử dụng thành công hoàn
toàn ở chuột khi chuyển các đoạn DNA dài được thiết kế trong các
vector BAC và YAC (Perry, 2001). Vì vậy phương pháp này có thể
được áp dụng rộng rãi đối với các loài khác kể cả gia súc lớn. Hiện
nay hạn chế của việc sử dụng ICSI ở các loài này là khó khăn.
Dường như là không thể áp dụng với các loài không thuộc bộ Linh
trưởng mà việc chuyển gen là khó khi sử dụng các phương pháp
khác.
Gần đây, một phương pháp tuyệt vời đã được đề xuất (Qian,
2001). DNA bám vào kháng thể đơn dòng nhận biết một protein trên
bề mặt tinh trùng hình thành nên một phức hợp ổn định với tinh
trùng. Phương pháp này đã được sử dụng để thụ tinh in vitro ở
chuột, gà bằng thụ tinh nhân tạo và lợn bằng cách tiêm vào sừng tử
cung. Trong ba trường hợp này, khoảng 30% cá thể con sinh ra là
động vật chuyển gen. Gen chuyển đã không bị sắp xếp lại. Nó đã
biểu hiện và truyền lại cho thế hệ sau. Ðiều quan tâm là kháng thể
đơn dòng giống nhau nhận biết tinh trùng của động vật có xương
sống thấp hơn và cao hơn kể cả con người. Phương pháp này có thể
được dùng để tạo Linh trưởng chuyển gen.
2. Chuyển gen vào tiền thể tinh trùng in vitro
Tinh trùng thành thục được tạo ra từ các tế bào gốc thông qua
các giai đoạn khác nhau của sự biệt hóa (Hình 2.25). Các tế bào gốc
tinh trùng có thể được tách chiết, nuôi cấy in vitro trong một thời
gian ngắn và được cấy chuyển vào tinh hoàn nhận. Các tế bào cấy
chuyển này hoạt động theo chương trình biệt hóa của chúng làm cho

89

tinh trùng hoạt động chức năng. Tỉ lệ tinh trùng tạo thành từ các tế
bào gốc cấy chuyển được tăng lên nhiều nhờ sự xử lý các con đực
nhận với bisulfan. Bisulfan là một loại thuốc ngăn cản sự biệt hóa
của tế bào gốc tinh hoàn. Protocol này đã được sử dụng một cách
thành công để chuyển gen vào tế bào gốc trong quá trình nuôi cấy.
Ðiều này đạt được nhờ sử dụng vector retrovirus hiệu quả. Các tế
bào gốc cấy chuyển vào con đực nhận đã xử lý bisulfan dẫn đến kết

Hình 2.25: Sử dụng các tế bào tiền thể của tinh trùng để chuyển gen
A. Các bước khác nhau của sự biệt hóa tế bào gốc thành tinh trùng
B. Các tế bào gốc hoặc các tế bào đã biệt hóa một cách cục bộ được
tách chiết, nuôi cấy và chuyển DNA chọn lọc vào. Tinh trùng
mang DNA ngoại lai này được sử dụng để thụ tinh bằng phương
pháp ICSC
C. Tế bào gốc được tách chiết, nuôi cấy dưới những điều kiện ngăn
cản sự biệt hóa của chúng, được chuyển DNA ngoại lai vào, được
chọn lọc và đưa vào lại một tinh hoàn nhận, nơi mà chúng biệt hóa.
Tinh trùng tạo ra được sử dụng để thụ tinh trứng bằng phương
pháp thông thường

90

quả là tạo ra chuột chuyển gen với tỉ lệ cao, khoảng 4%(Nagano,
2001). Phương pháp này là hữu dụng để nghiên cứu ảnh hưởng sinh
học của gen trong quá trình thành thục tế bào gốc tinh trùng và để
tạo động vật chuyển gen. Có thể suy ra phương pháp này ít thành
công hơn đối với các loài lớn hơn chuột. Dường như cần thiết phải
sử dụng các tế bào đã được biến nạp cao hơn để tăng cơ hội định cư
ở tinh hoàn với một tỉ lệ chấp nhận được.
2.2. Chuyển gen vào tiền thể của tinh trùng in vivo
DNA liên kết với thể chuyển nhiễm có thể được tiêm vào các
ống sinh tinh (Hình 2.26). Một số nhóm nghiên cứu đã thành công
trong việc tạo chuột chuyển gen bằng cách sử dụng tinh trùng của
các động vật đã được xử lý (Sato, 2002). Những kết quả khích lệ này
có hiệu quả vừa phải và hãy còn chưa đạt chuẩn. Hiện chúng đang
được cải tiến nhưng chắc chắn là chưa có cách nào làm cho có thể áp
dụng rộng rãi phương pháp này đối với các động vật lớn hơn chuột.
Quả thực cấu trúc của các ống dẫn tinh khác nhau và việc tiêm
DNA là khó. Mặt khác, lượng DNA tiêm vào có thể là rất lớn và khó
điều khiển.

Hình 2.26: Chuyển gen vào tiền thể của tinh trùng một cách trực tiếp
DNA bình thường hoặc DNA bám vào thể chuyển nhiễm được tiêm trực
tiếp vào các ống sinh tinh. Các tế bào đã hợp nhất DNA ngoại lai sẽ tạo ra
động vật chuyển gen sau khi thụ tinh bình thường

91

Một điểm khác cũng cần được nghiên cứu. Ðó là ở chuột, gen
chuyển vào tiền thể của tinh trùng in vivo xảy ra một cách độc lập
trong các tế bào khác nhau dẫn đến tạo ra các động vật sơ sinh có sự
hợp nhất khác nhau. Ðây là một thuận lợi vì sự hợp nhất khác nhau
có thể cho các kiểu hình hơi khác biệt. Với phương pháp này, các
nhà nghiên cứu có thể đánh giá các dòng động vật chuyển gen phức
tạp từ một thí nghiệm đơn giản.
XII. Kỹ thuật viên gen (Gene pill)
Kỹ thuật viêm gen một phương pháp điều trị bệnh bằng liệu
pháp gen thông qua đường uống thuốc.
Một lượng DNA liệu pháp (dạng plasmid hay phức hợp DNApeptid) được bọc bởi một màng lipid hỗn hợp đặc hiệu như màng
bọc các viên thuốc thông thường tạo ra viên gen. Viên gen được đưa
vào cơ thể theo đường miệng bằng cách uống. Sau khi được được
phóng thích, gen liệu pháp được hấp thụ qua màng đi vào tế bào biểu
mô ruột. Ở đây gen liệu pháp được phiên mã và dịch mã thành
protein dược phẩm. Protein dược phẩm tiết vào máu, đến các mô
bệnh để ức chế sự hoạt động của các gen bệnh (Hình 2.27).
Kỹ thuật viên gen là một phương pháp mới (được cấp bằng
phát minh vào ngày 3/5/2001) lần đầu tiên được sử dụng để chữa
bệnh tiểu đường bằng cách sử dụng một viên gen được tạo thành từ
DNA mã hóa inssulin. Phương pháp này đã khắc phục được các hạn
chế của các phương pháp truyền thống như vấn đề liều lượng và
phân phối thuốc. Nó có thể cách mạng hóa liệu pháp gen và cho các
bệnh nhân một sự chọn lựa để đưa insulin vào cơ thể hàng ngày.
Tuy nhiên, tính có ích của viên gen sẽ phụ thuộc vào sự biểu
hiện và phân phối của gen trong các tế bào ruột non và hãy còn chưa
chắc chắn là có thích hợp đối với các protein cần thiết với liều lượng
khớp một cách tinh vi không.

92

Hình 2.27: Sơ đồ cơ chế hoạt động của viên gen
1. Viên gen phân phối DNA đến ruột non
2. DNA được hấp thụ vào các tế bào ruột
3. Protein dược phẩm tổng hợp trong các tế bào
4. Protein dược phẩm tiết vào máu

Kỹ thuật viên gen khai thác một cách tích cực khoảng thời
gian sống ngắn của các tế bào biểu mô và tính có lợi của sự phân
chia một cách nhanh chóng của các tế bào đích xếp thành hàng trong
ruột non. Về mặt lý thuyết, liệu pháp gen thông qua đường uống có
thể phân phối gen tổng hợp bất cứ protein nào cho một loại tế bào
đơn trong ruột non, đáp ứng được yêu cầu tìm ra vector hoặc chiến
lược biến nạp mới cho mỗi một loại tế bào đích. Tuy nhiên phương
pháp này cho hiệu quả chưa cao do sự sử dụng các tế bào ruột non
làm các tế bào đích bị giảm bởi nhiều nhóm tế bào có thời gian sống
ngắn (2-3 ngày), môi trường acid và DNAse trong hệ dạ dày ruột.
Mặt khác, viên gen chỉ có thể mang các gen ngoại lai có kích thước
nhỏ. Hiện nay người ta mới chỉ tạo ra được một số loại viên gen sử
dụng trong điều trị thử nghiệm. Trong tương lai viên gen sẽ trở
thành một kỹ thuật có hiệu quả để điều trị bệnh bằng liệu pháp gen.

93

Tài liệu tham khảo chính
Makrides SC. 2003. Gene Transfer and Expression in
Mammalian Cells. Elsevier Science B. V. USA.
Louis-Marie H. 2003. Animal Transgenesis and Cloning.
John Wiley and Sons, Ltd. USA.
Glick BR., Jackj P. 1994. Molecular Biotechnology. ASM
Press. Washington D.C. USA.
Chopra VL., Anwan N. 1990. Genetic Engineering and
Biotechnology. Oxford and IBH Publishing CO.PVT, Ltd. UK.
John D, Roderick S, Philip A, Richard W. 1988. Plant
Genetics Transformation and Gene Expression (A Laboratory
Manual). Blackwell Scientific Publications. UK.