Tải bản đầy đủ
Hỡnh 2.22: Chuyn gen bng sỳng bn gen

Hỡnh 2.22: Chuyn gen bng sỳng bn gen

Tải bản đầy đủ

83

Bt. Gen Bt đã được bắn vào mô sẹo của cây ngũ cốc
(Rassmussen, 1994). Trong khi các tế bào này sửa chữa tổn thương,
DNA ngoại lai xâm nhập vào genome tế bào chủ. Vì vậy cho phép tế
bào chủ phiên mã và giải mã gen Bt. Sau mỗi lần quá trình biến nạp
được hoàn thành người ta cũng tiến hành sàng lọc theo phương pháp
truyền thống là dựa trên cơ sở các marker chọn lọc được xen vào
DNA cấu trúc (Brettschneider, 1997). Các marker chọn lọc mang
tính kháng (kháng thuốc kháng sinh hay kháng thuốc diệt cỏ) như
kanamycin là một là một trong những marker phổ biến nhất được sử
dụng.
- Tiêm chủng vaccine di truyền: các gen được đưa vào cơ thể
bằng súng bắn gen với mục đích gây ra phản ứng miễn dịch với
protein biểu hiện bởi gen chuyển. Phương pháp tiêm chủng vaccine
này an toàn hơn các phương pháp khác bởi vì chỉ DNA ngoại lai
được đưa vào và không có các protein ngoại lai (Lin, 2000).
- Liệu pháp gen tự sát (Suicide gene therapy): phương pháp
bắn gen đã được sử dụng trong điều trị bệnh ung thư. Một gen biểu
hiện protein gây độc có promoter đặc hiệu khối u được đưa vào các
tế bào khối u. Khi protein này được biểu hiện thì tế bào khối u chết.
Protein này chỉ gây độc đối với các tế bào khối u bởi vì promoter đặc
hiệu cần cho sự biểu hiện chỉ được tạo ra trong các tế bào khối u
(Lin, 2000).
- Sự điều biến miễn dịch (Immunomodulation): phương pháp
này còn được sử dụng để chống lại ung thư. Sử dụng súng bắn gen,
một protein chỉ biểu hiện trong tế bào khối u nhưng làm cho phản
ứng miễn dịch tăng lên được đưa vào tế bào. Phản ứng miễn dịch
tăng lên nhắm vào các tế bào khối u và hiển nhiên gây ra hiệu quả
mong muốn (Lin,2000).
- Dược lý di truyền: súng bắn gen có thể được sử dụng để đưa
các gen tổng hợp protein hữu ích hay protein liệu pháp vào cơ thể.
Ví dụ như các yếu tố đông máu ở các cơ thể rối loạn sự đông máu
hoặc tăng sự tổng hợp hồng cầu trong các cơ thể thiếu máu. Sự biểu
hiện kéo dài của các gen đưa vào là một vấn đề, trong nhiều trường
hợp thường đòi hỏi sự phân phối gen phức tạp (Lin, 2000).
- Súng bắn gen là một công cụ nghiên cứu: súng bắn gen có thể
được sử dụng để xen các promoter mà sẽ dẫn đến sự biểu hiện của

84

các gen nhất định. Hiệu quả khuyếch đại các protein nhất định là
một phương pháp có giá trị lớn đối với các nhà khoa học để nghiên
cứu chức năng của các protein này (Lin, 2000).
X. Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium
Agrobacterium có khả năng xâm nhiễm tế bào thực vật bằng
cách chuyển một đoạn DNA của nó vào tế bào thực vật. Khi DNA vi
khuẩn được hợp nhất với nhiễm sắc thể thực vật, nó sẽ tấn công vào
hệ thống tổ chức của tế bào một cách có hiệu quả và sử dụng nó để
đảm bảo cho sự sinh sôi của quần thể vi khuẩn. Thật không may mắn
cho các nhà trồng cây ăn quả khi gặp phải loài vi khuẩn này. Bởi vì
nó chính là thủ phạm gây ra bệnh khối u hình chóp và bệnh lông rễ ở
nhiều loài cây cảnh và cây ăn quả.
Mặc dù hệ thống chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium là
có hiệu quả đối với một số loài nhưng không phải tất cả thực vật có
thể được biến nạp bằng con đường này. Ðặc biệt, lớp một lá mầm
bao gồm các cây ngũ cốc chính trên thế giới như lúa, lúa mì và ngô
là không được biến nạp dễ dàng nhờ A. tumefaciens.
Ðể khai thác và sử dụng A. tumefaciens như là một vector
chuyển gen các nhà khoa học đã loại bỏ các gen gây khối u và gen
mã hoá opine của T - DNA và thay thế vào đó là các marker chọn
lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải và bờ trái của T-DNA và
các gen vir. Gen chuyển được xen vào giữa các vùng bờ của TDNA. Nó sẽ được chuyển vào tế bào và trở nên hợp nhất với nhiễm
sắc thể tế bào thực vật
Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium đã được
kiểm tra đối với sự xâm nhập bền vững, sự biểu hiện và sự di truyền
của các gen chuyển đặc biệt. Tuy nhiên, một vài yếu tố ảnh hưởng
đến hiệu quả biến nạp là loại mô được biến nạp, giai đoạn phát triển
của mô, mức độ khởi đầu của vi khuẩn A. tumefaciens sử dụng, môi
trường để nuôi cấy mô sau khi biến nạp, marker được sử dụng để
chọn lọc thể biến nạp, loại vector sử dụng và kiểu gen của thực vật.

85

Hình 2.23: Tạo thực vật chuyển gen bằng phương pháp chuyển gen
gián tiếp nhờ Agrobacterium

86

XI. Chuyển gen vào tinh trùng và các tiền thể của tinh
trùng
1. Chuyển gen vào tinh trùng
Tinh trùng trưởng thành có genome bất hoạt không có khả
năng tái bản. DNA của nó được bao phủ bởi protamine làm cho
DNA ngoại lai rất khó đi vào trong genome tinh trùng. Vì vậy DNA
ngoại lai không có cơ hội để hợp nhất vào DNA tinh trùng.
Các thí nghiệm thực hiện cách đây khoảng gần một thập kỷ
cho thấy rằng tinh trùng ủ với DNA có thể mang DNA đến trứng
trong quá trình thụ tinh dẫn đến kết quả là tạo ra chuột chuyển gen.
Các nghiên cứu hóa sinh học cho thấy DNA bám vào tinh trùng một
cách dễ dàng nhưng không chứng minh được rằng điều này xảy ra
do sự xâm nhập của DNA. Vì thế tinh trùng đóng vai trò là một thể
truyền đối với DNA ngoại lai.
Sau một vài năm, phương pháp này được áp dụng rộng rãi với
bò, lợn, cừu và cá medaka (Hình 2.24). Trong tất cả các trường hợp
này không hiểu tại sao các thí nghiệm rất khó thành công. Hơn nữa,
phần lớn các trường hợp, DNA ngoại lai hợp nhất vào genome vật
chủ đã được sắp xếp lại ở mức độ cao. Một nghiên cứu đã cho thấy
rằng ngay cả sau khi đã rửa cẩn thận, tinh trùng chứa DNAse đã
phân hủy DNA ngoại lai. DNAse có rất nhiều trong nguyên sinh chất
của tinh trùng và lượng enzyme này bám vào tinh trùng là thay đổi
đã giải thích tại sao thí nghiệm này không thành công và tại sao
DNA ngoại lai bị phân cắt. DNA ngoại sinh dường như gây ra hoạt
tính DNAse ở tinh trùng đã tách chiết ra. Có thể giải thích hiện
tượng này là DNAse một phương tiện để bảo vệ tinh trùng tránh
khỏi sự nhiễm DNA ngoại sinh trên đường từ mào tinh hoàn đến tế
bào trứng (Baccetti và Spadafora, 2000).
Các thử nghiệm để tăng DNA xâm nhập vào tinh trùng đã
được thực hiện. Sự xung điện hoặc chuyển nhiễm với các tác nhân
hóa học đã làm tăng sự hấp thu DNA vào tinh trùng. Hiện tượng này
thường được kèm theo do khả năng thụ tinh cho bào trứng của tinh
trùng.
Ở Xenopus, chuyển gen vào phôi bằng vi tiêm dẫn đến sự
biểu hiện của gen ngoại lai và nó tồn tại từ vài ngày đến vài tuần
nhưng lại không hợp nhất vào genome vật chủ. Ðể khắc phục khó

87

Hình 2.24: Chuyển gen vào tinh trùng
A. Tinh trùng đã rửa ủ với DNA được sử dụng để thụ tinh in vivo
hoặc in vitro. Phương pháp này không có hiệu quả đặc hiệu đối với
việc tạo động vật chuyển gen và các gen đã hợp nhất thường bất
hoạt do sự sắp xếp lại DNA
B. Màng tinh trùng bị tổn thương bởi chất tẩy nhẹ. DNA ngoại lai đi
vào tinh trùng một cách tự do. Các tinh trùng này được sử dụng để
thụ tinh in vitro bằng phương pháp ICSI

khăn này, các nhà nghiên cứu đã sử dụng tinh trùng làm thể mang
(carrier). Protocol đã được xác định sớm hơn cho động vật có vú đã
chứng tỏ không hiệu quả ở Xeponus. Ðể tăng khả năng hấp thu
DNA, tinh trùng được xử lý với Triton, một chất tẩy nhẹ. Ðiều này
dẫn đến sự không ổn định của màng tinh trùng làm cho DNA tự do
đi vào tinh trùng. Kết quả tương tự cũng đạt được khi làm lạnh và
ấm tinh trùng. Chromatin đã bị phân hủy do enzyme hạn chế nhận
biết một vài vị trí ở chromatin của tinh trùng nhưng đối với DNA
ngoại lai thì không xảy ra. Ðiều này gây ra cơ chế sửa chữa và làm
tăng cơ hội hợp nhất DNA ngoại lai vào genome của phôi. Phương
pháp này có tên gọi là REMI (restriction enzyme mediated
intergration=sự hợp nhất qua trung gian ezyme hạn chế), một
phương pháp làm tăng sự biến nạp của tế bào. Sau các xử lý này,

88

tinh trùng mất khả năng thụ tinh cho trứng. Tiêm trực tiếp tinh trùng
vào trứng (intra-cytoplasmic sperm ịnjection=ICSI) được sử dụng
đối với sự thụ tinh in vitro ở người. Phương pháp này đã được áp
dụng cho Xeponus và đã tạo ra Xeponus chuyển gen với kết quả có
thể chấp nhận (Hình 2.12B). Ðặc biệt hiện nay các nhà sinh học đã
ứng dụng chuyển gen vào loài này để nghiên cứu sự phát triển
(Marrsh-Arrmstrong, 1999; Perrny, 2001).
Phương pháp này, trước tiên được sử dụng cho Xeponus, đã
chứng tỏ thành công ở chuột. Tuy nhiên nó không cho kết quả cao
hơn phương pháp vi tiêm vào tiền nhân là một phương pháp đơn
giản hơn nhiều. Phương pháp ISCI đã được sử dụng thành công hoàn
toàn ở chuột khi chuyển các đoạn DNA dài được thiết kế trong các
vector BAC và YAC (Perry, 2001). Vì vậy phương pháp này có thể
được áp dụng rộng rãi đối với các loài khác kể cả gia súc lớn. Hiện
nay hạn chế của việc sử dụng ICSI ở các loài này là khó khăn.
Dường như là không thể áp dụng với các loài không thuộc bộ Linh
trưởng mà việc chuyển gen là khó khi sử dụng các phương pháp
khác.
Gần đây, một phương pháp tuyệt vời đã được đề xuất (Qian,
2001). DNA bám vào kháng thể đơn dòng nhận biết một protein trên
bề mặt tinh trùng hình thành nên một phức hợp ổn định với tinh
trùng. Phương pháp này đã được sử dụng để thụ tinh in vitro ở
chuột, gà bằng thụ tinh nhân tạo và lợn bằng cách tiêm vào sừng tử
cung. Trong ba trường hợp này, khoảng 30% cá thể con sinh ra là
động vật chuyển gen. Gen chuyển đã không bị sắp xếp lại. Nó đã
biểu hiện và truyền lại cho thế hệ sau. Ðiều quan tâm là kháng thể
đơn dòng giống nhau nhận biết tinh trùng của động vật có xương
sống thấp hơn và cao hơn kể cả con người. Phương pháp này có thể
được dùng để tạo Linh trưởng chuyển gen.
2. Chuyển gen vào tiền thể tinh trùng in vitro
Tinh trùng thành thục được tạo ra từ các tế bào gốc thông qua
các giai đoạn khác nhau của sự biệt hóa (Hình 2.25). Các tế bào gốc
tinh trùng có thể được tách chiết, nuôi cấy in vitro trong một thời
gian ngắn và được cấy chuyển vào tinh hoàn nhận. Các tế bào cấy
chuyển này hoạt động theo chương trình biệt hóa của chúng làm cho