Tải bản đầy đủ
III. Chuyn gen qua liposome

III. Chuyn gen qua liposome

Tải bản đầy đủ

60

phân phối cao hơn. Sự dung hợp của liposome với màng plasma là
một sự kiện hiếm. Hiệu quả biến nạp của phương pháp này thấp hơn
so với phương pháp vi tiêm vào tiền nhân. Các nổ lực nghiên cứu
đang được tiến hành để tìm ra các điều kiện thí nghiệm mà có thể
làm tăng sự phóng thích các phân tử đã kết nang từ con đường ẩm
bào.

Hình 2.3: Cấu trúc tổng quát của lipid cation tổng hợp

Hình 2.4: Cấu trúc của DOPE (L-diolecyl phosphatidylethanolamine)

Hình 2.5: Phức hợp liposome-DNA

61

Hình 2.6: Sơ đồ hoạt động của vector liposome

Liposome đã được sử dụng để đưa protein, lipid và các phân
tử nhỏ vào nhiều loại tế bào nuôi cấy, tuy nhiên hiệu quả thấp hơn vi
tiêm đối với RNA hoặc protein. Cũng như thế, chuyển gen qua
liposome và sự biểu hiện của gen chuyển là không vượt qua được
các phương pháp chuyển gen thông thường (như hệ thống virus), sự
biểu hiện gen chuyển thường nhất thời, sự ức chế bởi các thành phần
của huyết thanh có thể xảy ra. Bên cạnh đó, kỹ thuật này có nhiều ưu
điểm là gen chuyển sẽ không hợp nhất vào genome chủ, có hiệu quả
tốt đối với cả tế bào in vitro và in vivo, có thể mang được các DNA
có kích thước rất lớn, độ tinh khiết cao, không gây miễn dịch, có thể
sử dụng với các tế bào mà biến nạp bằng kỹ thuật calcium phosphat
không có hiệu quả..

62

Ứng dụng trong tương lai của kỹ thuật này chủ yếu sẽ là khả
năng phân phối thuốc vào các tế bào của cơ thể sống. Hiện nay kỹ
thật này đang được phát triển để cải tiến sự phân phối đặc hiệu của
liposome bằng cách ghép các kháng thể đặc hiệu với bề mặt của
liposome đích.

IV. Phương pháp vi tiêm
Sự thành công đầu tiên trong nghiên cứu tạo chuột chuyển gen
bằng phương pháp vi tiêm vào tiền nhân đã được công bố vào năm
1980 (Gordon, 1980). Mặc dầu cấu trúc tổ hợp gen chuyển được
chứng minh là đã tích hợp vào genome của chuột, nó đã được sắp
xếp lại nhưng gen ngoại lai không được biểu hiện. Các công bố tiếp
theo (Brister, 1981; Costantini và Lacy; 1981) chứng minh rằng với
phương pháp vi tiêm, các gen chuyển đã tích hợp và có khả năng
biểu hiện. Vào năm 1982, lần đầu tiên sự thay đổi kiểu hình có thể
nhìn thấy ở chuột nhắt chuyển gen đã được mô tả (Palmiter, 1982).
Ðây là kết quả biểu hiện của gen hormon sinh trưởng chuột cống ở
chuột nhắt. Từ đó đến nay đã có rất nhiều các công trình về chuyển
gen, trong đó phần lớn là các nghiên cứu hiệu quả của gen vi tiêm
với sự sinh trưởng của động vật có vú và bệnh học.
Nguyên tắc của phương pháp vi tiêm là một lượng nhỏ DNA
được tiêm trực tiếp vào nhân tế bào phôi trần hoặc tế bào nguyên
vẹn một cách cơ học dưới kính hiển vi. Phương pháp này cho phép
đưa gen vào đúng vị trí mong muốn ở từng tế bào với hiệu quả tương
đối cao.Tuy nhiên do đòi hỏi phải tinh vi, tỉ mỉ và cực kỳ chính xác
nên hạn chế số lượng tế bào vi tiêm và ngoài ra còn có thể làm tổn
thương đến tế bào phôi do tác nhân cơ học gây ra khi tiến hành vi
tiêm.
Ðể biến nạp gen vào tế bào bằng phương pháp vi tiêm trước hết
phải chế tạo kim tiêm và kim giữ. Kim được tạo ra từ những ống
thuỷ tinh dẻo capillar đường kính 0,1-1,5 mm có sợi bằng wolfram
mảnh ở trong nhờ hệ thống thiết bị làm kim. Hệ thống này gồm có
máy kéo kim tự động (pipette puller), máy mài kim và máy gia cố
kim.

63

Hình 2.7: Vi tiêm gen ngoại lai vào tiền nhân của trứng thụ tinh

Ðể tạo kim tiêm trước hết phải tạo ra đầu kim nhọn nhờ máy
kéo kim. Sau đó sử dụng máy gia cố để cắt đầu nhọn của ống
capillar sau khi kéo tạo ra mũi kim tiêm có đường kính thích hợp.
Ðường kính bên trong mũi kim tiêm tuỳ thuộc vào loại tế bào
chuyển gen. Ðối với trứng tiền nhân động vật có vú có đường kính
khoảng 70 µm thì đường kính của kim tiêm khoảng 0,75 µm là thích
hợp, đối với phôi cá một tế bào đường kính của kim tiêm là khoảng
3-4 µm. Cuối cùng đưa kim lên máy mài để làm sắc nhọn và trơn
láng đầu kim (Hình 2.8).
Kim giữ được chế tạo từ những ống capillar có đầu nhẵn bình
thường để cố định trứng trong quá trình vi tiêm. Ðể tạo kim giữ,
dùng máy kéo kim tự động để tạo ra đầu kim nhỏ sau đó dùng bút
kim cương hoặc sợi platin đốt nóng cắt bớt đầu nhọn để tạo ra đầu
kim với đường kính thích hợp. Làm nhẵn đầu kim giữ bằng cách để
đứng kim này ngay trên mặt đoạn cong platin của máy gia cố. Ðốt
nóng sợi platin và điều chỉnh đầu kim giữ cho nó chảy từ từ. Quan
sát dưới kính hiển vi và dừng lại khi đầu kim đã đạt yêu cầu.

64

Vi tiêm được tiến hành trên hệ thống thiết bị vi tiêm (Hình 2.9).
Hệ thống này gồm có hai bộ phận chính là kính hiển vi và máy vi
thao tác.

Hình 2.8 : Các máy làm kim (Hãng Narishige)
1. Máy gia cố kim Microforge
2. Máy mài kim
3. Máy kéo kim tự động Pipette Puller

Kính hiển vi dùng cho mục đích này là kính hiển vi soi
ngược (vật kính xoay ngược lên). Ðộ phóng đại thích hợp cho việc
tiến hành vi tiêm vào phôi cá một tế bào là khoảng từ 40-60 lần.
Máy vi thao tác gồm 2 phần giống hệt nhau được bố trí hai bên kính
hiển vi, một dùng để điều chỉnh kim tiêm, một dùng cho kim giữ.
Tính năng của máy này là cho phép điều chỉnh các kim theo không
gian 3 chiều. Kim tiêm và kim giữ được lắp vào máy vi thao tác và
được nối với syringe qua ống bằng chất dẻo được nạp đầy dầu
parafin.
Chuẩn bị dung dịch gen chuyển: gen chuyển được xen vào
trong một vector plasmid và tạo dòng trong E.coli. Các vi khuẩn
biến nạp mang plasmid tái tổ hợp được phát hiện trong môi trường