Tải bản đầy đủ
Hỡnh 1.2: Cu trỳc ca transposon

Hỡnh 1.2: Cu trỳc ca transposon

Tải bản đầy đủ

16

Các vector khác được sử dụng để tạo côn trùng chuyển gen
như Aedes aegypti hoặc tằm (Tamura, 1999). Gần đây transposon đã
được sử dụng để tạo chuột chuyển gen (Dupuy, 2002).

Hình 1.3: Sử dụng vector transposon để chuyển DNA ngoại lai
Gen transposase được thay thế bằng gen mong muốn. Transposon tái tổ
hợp được tiêm vào tế bào. Vector điều khiển sự tổng hợp enzyme gắn
(intergrase) được cùng tiêm vào. Transposon được hợp nhất bằng cách sử
dụng các trình tự lặp lại đảo ngược ITR của chúng

Trong tất cả các trường hợp, transposon và plasmid mã hóa
cho transposase phải được tiêm vào tế bào chất của phôi dưới các
điều kiện khác nhau tùy thuộc từng loài. Về phương diện này, gà là
khác với hầu hết các loài khác. Việc tiêm gen có thể được thực hiện
ở giai đoạn phôi một tế bào mà không thể đưa trở lại vào con mẹ
nuôi dưỡng như trường hợp đối với thú. Phôi tiêm gen phải được
đưa vào noãn hoàng của một trứng không mang phôi. Sau vài tuần
ấp trứng dưới các điều kiện được kiểm soát tốt, gà chuyển gen được
sinh ra với một tỉ lệ thành công có thể chấp nhận (Shermann, 1998).

17

Vì vậy, vector transposon cho phép tạo ra các động vật
chuyển gen đối với các loài mà vi tiêm DN A thông thường không
thành công. Vector này cũng được xem là an toàn. Vector
transposon thủy thủ ngay cả khi thiếu gen transsposae của nó cũng
có thể tái bản và hợp nhất vào genome chủ với tần số thấp. Ðiều này
là do sự có mặt của transposase nội sinh của tế bào chủ. Vấn đề này
có thể giới hạn sự sử dụng transposon trong một số trường hợp.
Trong khi đó, transposon BAC lợn con đã được sử dụng để tạo ra
tằm chuyển gen ổn định hoàn toàn sau một số thế hệ.
Transposon chỉ có thể mang các đoạn DN A ngoại lai với
chiều dài giới hạn. Các cấu trúc phức tạp được sử dụng để biểu hiện
gen ngoại lai rõ ràng cũng là một hạn chế. N goài ra các cơ chế tế bào
phá hủy transposon có thể ức chế sự biểu hiện của gen chuyển trong
một số trường hợp.
1.1.4. Vector retrovirus
a. Cấu trúc của retrovirus
Retrovirus là loại virus RN A, có vỏ bọc bên ngoài. Sau khi
xâm nhiễm, genome virus được sao chép ngược thành DN A sợi kép,
hợp nhất vào genome tế bào chủ và biểu hiện thành protein.
Retrovirus đặc trưng bởi chu kỳ tái bản của chúng, được mô
tả lần đầu tiên vào đầu thập niên 1900 (Ellermann và Bang.O, 1908).
Hạt retrovirus có kích thước, hình dạng có thể thay đổi đôi
chút nhưng đường kính khoảng 100nm. Vỏ của virus là
glycoprotein, tạo thành các gai ở màng (Hình 1.4A). Protein trưởng
thành này được chia làm hai loại polypeptid (Hình 1.4B):
- Glycoprotein vỏ bên ngoài (SU), kháng nguyên chủ yếu của
virus, có chức năng bám vào thụ quan.
- Glycoprotein màng (TM), bám vào protein SU ở vỏ, chịu
trách nhiệm đối với sự dung hợp màng.

18

A

B

Hình 1.4: Sơ đồ cấu trúc cắt ngang của retrovirus

A. Cấu trúc cắt ngang

B. Cấu trúc protein vỏ

Bên trong màng là protein cơ bản (MA), không định hình.
Protein này bao lấy capsid (CA). CA là protein phong phú nhất trong
hạt virus (chiếm khoảng 33 % trọng lượng tổng số), có hình khối 20
mặt. Bên trong capsid là lõi, thường có hình nón, bao gồm: RN A
genome, protein nucleocapsid (N C), enzym phiên mã ngược (reverse
transcriptase = RT) và enzyme hợp nhất (intergrase = IN ).
Genome retrovirus bao gồm hai bản sao của phân tử RN A sợi
đơn, mạch thẳng, có cap ở đầu 5’ và đuôi poly A ở đầu 3’ (tương
đương với mRN A). Genome retrovirus có kích thước khoảng 811kb.
Retrovirus được chia làm hai loại là retrovirus đơn giản và
retrovirus phức tạp.
RN A của retrovirus đơn giản chứa 3 nhóm gen chủ yếu:
- Gen gas mã hóa protein lõi, capsid và nucleoprotein.
- Gen pol mã hóa enzyme phiên mã ngược và enzyme hợp
nhất.
- Gen env mã hóa protein trong cấu trúc vỏ của virus.
Trật tự của các nhóm gen này ở tất cả các retrovirus là không
thay đổi:
5’ – gag – pol – env – 3’

19

N goài ra còn có nhóm gen pro mã hóa enzyme protease
viruss. Các retrovirus đơn giản bao gồm hầu hết các virus gây ung
thư như viruss bạch cầu chuột Moloney Mo-MLV (Moloney, 1960),
virus ung thư tuyến vú chuột (mouse mammary tumor virus =
MMTV) (Bittner, 1936 ).
Các retrovirus phức tạp, ngoài ba nhóm gen chủ yếu gag, pol
và env còn có các gen khác như tat, rev ở HIV-1. N hóm virus này
bao gồm các lentivirus kể cả virus HIV-1, spumavirus, HFV (human
foamy virus) và SFV (simian foamy virus).
Ở mỗi đầu của genome là các đoạn lặp dài tận cùng (LTR)
chứa tất cả các tín hiệu cần thiết cho sự biểu hiện gen của virus. Một
đoạn LTR gồm có 3 vùng: U3, R và U5. Vùng U3 bao gồm các yếu
tố kiểm soát sự phiên mã, promoter và gen tăng cường (enhancer).
Ðây là vùng không mã hóa có kích thước 75-250 nucleotid, là phần
đầu tiên của genome được phiên mã ngược, tạo ra đầu 3’ của
genome provirus. Vùng R thường là trình tự có kích thước ngắn chỉ
khoảng 18-250 nucleotid tạo thành đoạn lặp trực tiếp ở cả hai đầu
của genome. Vùng U5 là vùng không mã hóa có kích thước 2001.200 nucleotid tạo nên đầu 5’ của provirus sau khi phiên mã ngược.
vùng U5 mang vị trí poly A và cùng với vùng R xác định sự gắn
thêm đuôi poly A vào. Cả hai vùng U3 và U5 đều mang vị trí gắn att
cần thiết cho sự hợp nhất genome của virus vào genome chủ.
Mặt khác, genome virus còn có đoạn dẫn đầu (leader), vị trí
bám primer (primer binding site = PBS) và vùng polypurine
(polypurine tract = PPT). Ðoạn dẫn đầu không được dịch mã, khá
dài, có kích thước khoảng 90-500 nucleotid, xuôi theo vị trí khởi đầu
phiên mã, nằm giữa vùng U3 và R, ở phía đầu 5’ của tất cả các virus
mRN A. PBT dài 18 nucleotid bổ sung với đầu 3’ của primer tRN A
đặc hiệu được virus sử dụng để bắt đầu phiên mã ngược. PTT ngắn
chỉ khoảng 10 A hoặc G có chức năng khởi đầu sự tổng hợp sợi (+)
trong quá trình phiên mã ngược.

Hình 1.5 : Sơ đồ cấu trúc genome của retrovirus