Tải bản đầy đủ
Câu hỏi chương 2:

Câu hỏi chương 2:

Tải bản đầy đủ

89
3. Phương pháp đun sôi điều chế plasmid với lượng nhỏ?

4. Phương pháp loại bỏ Cesium chloride trong điều chế plasmid sử dụng ly tâm
phân đoạn?
5. Phương pháp xác định hiệu giá phage lambda?
6. Phương pháp dung giải trên đĩa khi điều chế phage lambda?
7. Các phương pháp đánh dấu DNA bằng phóng xạ?
8. Trình bày phương pháp lọc gel Sephadex G-50 tự chế để làm sạch DNA phóng
xạ?
9. Phương pháp tạo cột ly tâm Bio-Gel P-60 và sử dụng trong điều chế DNA
phóng xạ?
10. Đánh dấu DNA bằng digoxygenin nhờ phương pháp nhiều mồi?
11. Đánh dấu DNA bằng digoxygenin nhờ PCR?
12. Vì sao điều chế RNA lại gặp nhiều khó khăn hơn so với điều chế DNA?
Phương pháp cải thiện?
13. Phương pháp guanidine thiocyanate trong điều chế RNA?
14. Phương pháp phenol nóng trong điều chế RNA?
15. Nêu phương pháp có thể sử dụng để phát hiện dòng thuần chứa cDNA đích?
16. Phương pháp điều chế RNA-polyA nhờ cột cellulose gắn d(T)?
17.Kỹ thuật thu hồi mRNA đích theo phân đoạn nhờ li tâm chênh lệch nồng độ
saccharose?
18. Kỹ thuật kiểm định độ dài cDNA được tổng hợp có sự bổ sung nhân tố phóng
xạ [ -32P]dCTP?
19. Methyl hóa vị trí cắt của enzyme hạn chế Eco RI của cDNA: ý nghĩa và kỹ
thuật thực hiện?
20. Gắn đoạn nối Eco RI (Eco RI linker)?
21. Kỹ thuật kiểm tra xác nhận tổ hợp cDNA vào vector?
22. Các bước chủ yếu trong sàng lọc thư viện cDNA trong gt 10 nhờ mẫu dò
DNA tổng hợp?
23. Kỹ thuật cố định DNA lên màng và lai phân tử với mẫu dò DNA?
24. Trình bày các bước sàng lọc cDNA sử dụng mẫu dò đánh dấu bằng DIGdUTP?
25. Chuyển thấm protein và ủ mẫu dò kháng thể phát hiện clone sản xuất protein
đích được tạo dòng bằng phage gt 11?
26. Điều kiện để dòng hóa (cloning) DNA genome (genomic DNA cloning) khả
thi?
27. Các kỹ thuật có thể sử dụng để tạo những đoạn DNA động vật đủ ngắn có thể
biến nạp?
28. Thí nghiệm cắt DNA động vật thành từng phần bằng Sau 3A: nguyên tắc và
ứng dụng?
29. Điều chế đoạn DNA động vật đã cắt bằng Sau 3A để tạo tổ hợp?
30. Vector plasmid và cosmid?

PGS Phạm Hông Sơn * Kỹ thuật cơ bản trong sinh học phân tử

90
31. Tạo tế bào khả biến hay chịu di nạp (competent cell): nguyên tắc và các kỹ

thuật?
32. Điều chế vector plasmid và DNA cần gắn trong tạo dòng phụ?
33. Nguyên lý của việc phân tích điều tiết phiên mã nhờ thử nghiệm CAT (CAT
assay)?

PGS Phạm Hông Sơn * Kỹ thuật cơ bản trong sinh học phân tử

91

Chương 3

KỸ THUẬT PHÂN TÍCH XÁC NHẬN PHÂN TỬ
I. Kỹ thuật lai Southern (Southern hybridization)
Kỹ thuật chuyển/lai Southern (hay phương pháp Southern
transfer/hybridization) là tổ hợp kỹ thuật được Southern sáng tạo được
công bố vào 1975, nhờ đó có thể đồng định một nucleic acid làm mẫu dò,
hay dò (probe) đã đánh dấu với một DNA có miền mang trình tự
nucleotide bổ sung, tức là dùng mẫu dò đã biết để xác nhận sự hiện diện
của DNA tương đồng trong mẫu nghiệm, là một trong những phương pháp
hữu ích áp dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử. DNA mẫu nghiệm có
thể là nguyên vẹn. Thêm vào đó, trong nhiều trường hợp, sau khi cắt DNA
bằng enzyme hạn chế và điện di trong gel agarose để phân li rồi chuyển
qua và cố định trên màng nitrocellulose (hoặc màng nylon, sau này hay
dùng hơn do bền và cố định DNA rất tốt và có thể tái sử dụng), thực hiện
lai với mẫu dò đã đánh dấu có thể kiểm xuất được những đoạn DNA trên
màng có trình tự bổ sung với mẫu dò.
Thí nghiệm trình bày dưới đây là nguyên gốc sử dụng mẫu dò
(probe) đánh dấu phóng xạ. Ngày nay các mẫu dò đánh dấu phi phóng xạ
đã phổ biến, có thể đặt mua và vận dụng thay thế, khi đó phương pháp
autoradiography (tự ký phóng xạ) được thay thế bằng phương pháp
fluorography (huỳnh quang ký, hoặc sử dụng thiết bị đọc non-RI
fluorescence, như FMBIO II Multi-View, chẳng hạn) hoặc phương pháp
đánh dấu biotin phát hiện được nhờ streptavidin (hoặc DIG phát hiện bằng
kháng thể đặc hiệu DIG, tương ứng) đánh dấu enzyme akaline phosphatase
(AP) để nhận biết kết quả lai với sự hỗ trợ của hợp chất quang hóa
(chemiluminescent substrate) như CDP-Star, Lumi-Phos 530, CSDP (hoặc
đánh dấu enzyme horse radish peroxidase (HRPO) với cơ chất quang hóa
là ECL hoặc LumiGLO). Phương pháp trình bày dưới đây sử dụng mẫu dò
đánh dấu phóng xạ như ban đầu phát kiến ra phương pháp này.

PGS Phạm Hông Sơn * Kỹ thuật cơ bản trong sinh học phân tử

92
1. Chuyển Southern (Southern transfer)
1) Phân giải DNA mẫu bằng enzyme hạn chế, điện di để phân li trong gel
agarose. Khi đó nên điện di đồng thời trong 1 làn gel DNA MW marker đã
đánh dấu phóng xạ như [32P]Hind III marker DNA, chẳng hạn.
Chú ý: cũng có cách khác là dùng DNA MW marker không đánh
dấu phóng xạ nhưng sau khi điện di (trong gel chứa ethidium bromide) thì
đặt dọc theo gel một thước milimetre phát huỳnh quang dưới UV và chụp
ảnh (bằng pollaroid film) (hoặc đo đoạn đường dịch chuyển của các băng
đích nếu bản gel điện di với số lượng làn hạn chế) để đánh dấu kích thước
phân tử theo độ dài dịch chuyển các băng.
2) Ngâm gel vào 150 ml dung dịch NaOH 0,2N - NaCl 0,6M, trộn lắc nhẹ
trong 30 phút đến 1 giờ để làm biến tính DNA. Chú ý không ngâm gel
agarose quá lâu trong dung dịch kiềm vì gel sẽ bị mềm và dễ vỡ và dính
vào màng khi chuyển nucleic acid và làm cho màu nền (background) quá
đậm.
3) Rửa gel bằng nước loại ion rồi ngâm trong 150 ml Tris-HCl (pH 7,5)
0,6M trộn đảo nhẹ trong 1 giờ, giữa chừng thay dịch. Bằng cách này trung
hòa gel.
4) Cắt một tấm màng nitrocellulose hoặc nylon kích thước bằng kích thước
tấm gel, ngâm vào nước cất cho thấm ướt đều rồi ngâm vào dung dịch SSC
10×.
Dung dịch SSC 10× chứa 3 M NaCl và 0,3 M sodium
citrate (pH 7,0).

Hình 7: Sơ đồ chuyển nucleic acid nhờ tính thấm

PGS Phạm Hông Sơn * Kỹ thuật cơ bản trong sinh học phân tử