Tải bản đầy đủ
CHƯƠNG 3: VI SINH VẬT VÀ TIÊU CHUẨN LỰA CHỌN GIỐNG

CHƯƠNG 3: VI SINH VẬT VÀ TIÊU CHUẨN LỰA CHỌN GIỐNG

Tải bản đầy đủ

Tạo váng nhăn, dày và chắc.
Váng bắt màu xanh khi gặp H2SO4 và I2
Có thể tích lũy 4.5% acid acetic.
Được dùng trong công nghiệp sản xuất thạch dừa.
Acetobacter aceti:
• Trực khuẩn, ngắn, không di động và xếp thành chuỗi dài
• Váng bắt màu vàng khi gặp I2
• Có khả năng phát triển ở nông độ rượu cao (11%) và tích lũy được





-

-

6% acid acetic.
Acetobacter pasteurianum:
• Trực khuẩn, ngắn, không di động và xếp thành từng chuỗi dài
• Tạo váng khô, nhăn nheo và bắt màu xanh khi gặp I2

Bảng 29. Sự khác biệt giữa các loài Acetobacter

rances

ascendens

s peroxydan

paradoxum

r

lovaniensis

Acetobacter
ns mesoxyda

Giống

Đinh mao
Gluconobacte

xylinum

Chu mao

acetic

Đặc điểm tiên mao

ethanol thành CO2

+

+

+

+

+

+

+

+

-

và H2O
2. Catalase
3. Sinh trưởng

+

+

+

+

+

+

-

-

+

trong môi trường

+

-

-

+

-

-

+

-

-

+

+

+

+

+

-

-

-

+

Loài
1. Oxy hóa tiếp tục

Hoyer
4. Chuyển hóa
Glucose thành acid
gluconic

25

5. Chuyển hóa
Glycerol thành
dihydroxy - aceton
6. Tổng hợp
cellulose
7. Tạo sắc tố nâu

+

+

+

-

-

-

-

-

+

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

Dựa vào những ưu điểm vượt trội mà Acetobacter xylinum được chọn làm giống để
sản xuất thạch dừa và một số ứng dụng khác dùng trong y học và mỹ phẩm.
II. Vi khuẩn Acetobacter xylinum

Acetobacter Xylinum thuộc nhóm vi khuẩn acetic có nguồn gốc từ Philippines, là
loài vi khuẩn tạo được nhiều bacterial cellulose nhất trong tự nhiên. Một tế bào
A.xylinum có thể chuyển hóa 108 phân tử glucose thành cellulose trong 1 giờ.

Theo khóa phân loại của Bergey, A.xylinum thuộc:
Lớp Schizomycetes.
Bộ Pseudomonadales.
Họ Pseudomonadaceae.
1. Đặc điểm hình thái




A.xylinum có dạng hình que, thẳng, kích thước khoảng 2µm thay đổi tùy loại. Các
tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi (các chuỗi ngắn từ 6 – 8 tế bào), có thể di
động hoặc không, không sinh bào tử, gram (-). A.xylinum là loài hiếu khí bắt buộc do
đó chúng tăng trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trường lỏng và môi trường khí.

26

Hình 8. Vi khuẩn Acetobacter Xylinum
Khi phát triển trên môi trường nuôi cấy, các tế bào được bao bọc bởi chất nhầy tạo
thành váng nhăn khá dày, bắt màu xanh với thuốc nhuộm iod và acid sulfuric.
Trên môi trường thiếu thức ăn hoặc môi trường đã nuôi cấy lâu, A. xylinum dễ dàng
sinh ra những tế bào có hình thái đặc biệt: tế bào có thể phình to hoặc kéo dài, đôi khi
lại có dạng phân nhánh.

2. Đặc điểm sinh lí – sinh hóa

Acetobacter xylinum là vi sinh vật hiếu khí bắt buộc, cho phản ứng Catalase dương
tính. Nó có khả năng oxy hoá tiếp tục ethanol thành acid acetic CH 3COOH, chuyển
hoá được glucose thành acid, glycerol thành dihydroxyaceton, tổng hợp được cellulose
nhưng không có khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer và không tạo sắc tố nâu.
Theo Hestrin (1947), pH tối ưu để A. xylinum phát triển là 4,5 và nó không phát
triển ở 370C ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu. Theo Bergey, nhiệt độ tối ưu
để A. xylinum phát triển là 25 – 300C. Còn theo Marcormide (1996) thì A. xylinum có
thể phát triển ở pH từ 3 – 8, nhiệt độ là 12 – 35 0C và nồng độ ethanol lên đến 10%.
Bản thân nó có thể tích lũy 4,5% acid acetic (sản phẩm sinh ra trong quá trình hoạt

27

động của A. xylinum), tuy nhiên khi nồng độ của sản phẩm tăng lên quá cao thì chúng
lại bị ức chế ngược.
Nguồn carbohydrate mà A.xylinum sử dụng cho khả năng tạo sinh khối cao là
glucose, fructose, mannitol, sorbitol; hiệu suất sẽ thấp hơn khi sử dụng glycerol,
lactose, sucrose, maltose.
Acetobacter xylinum không sinh độc tố.
2.1.

Bacterial cellulose (BC)

Sự tổng hợp lớp màng cellulose ngoại bào của vi khuẩn A. xylinum được nhà
bác học Brown báo cáo lần đầu tiên vào năm 1886. Tuy nhiên đến nửa sau thế kỉ XX,
các nhà khoa học mới thực sự nghiên cứu rộng rãi về BC.
BC có cấu trúc hóa học tương tự như cấu trúc của cellulose thực vật (plant
cellulose - PC), là chuỗi polymer của các nhóm glucose liên kết với nhau qua cầu nối
β - 1,4 – glucan. Các chuỗi glucan liên kết với nhau bằng liên kết Valder waals tạo nên
lớp các chuỗi glucan. Lớp này chỉ tồn tại trong thời gian ngắn, sau đó lớp này sẽ liên
kết với nhau bằng liên kết hydro tạo thành các sợi cơ bản. Các sợi cơ bản liên kết với
nhau tạo thành vi sợi, rồi sau đó tạo thành các bó và các sợi.

Hình 9. Quá trình hình thành cellulose
So với PC thì BC có độ polymer hóa cao hơn và kích thước nhỏ hơn, BC có độ
polymer hóa từ 2000 – 6000, có trường hợp lên đến 16000 hay 20000. Trong khi đó,
khả năng polymer hóa của PC chỉ từ 13000 – 14000.
 Một số tính chất của BC:
• Độ tinh sạch: độ tinh sạch tốt hơn rất nhiều so với các cellulose khác,

có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn.
28



Độ bền cơ học: có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp,

ổn định về kích thước và hướng.
• Tính hút nước: có khả năng giữ nước đáng kể (lên đến 99%), có tính
xốp, ẩm độ cao, có thể chịu được một thể tích đáng kể trên bề mặt (lực
2.2.

bền cơ học cao).
Vai trò của cellulose đối với A.xylinum:

Theo Costeron (1999), trong môi trường tự nhiên, vi khuẩn có khả năng tổng hợp
các polysaccharide ngoại bào để hình thành nên lớp vỏ bảo vệ bao quanh tế bào, và
màng BC là một ví dụ như thế. Hệ thống lưới polymer làm cho các tế bào có thể bám
chặt trên bề mặt môi trường và làm cho tế bào thu nhận chất dinh dưỡng dễ dàng hơn
so với khi tế bào ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose. Một số nhà
khoa học còn cho rằng cellulose được tổng hợp bởi A. xylinum còn đóng vai trò tích
trữ và có thể được sử dụng khi vi sinh vật này thiếu nguồn dinh dưỡng. Sự phân hủy
cellulose đuợc xúc tác bởi enzyme exo – hay endo – glucanase, sự hiện diện cả hai loại
enzyme này được phát hiện trong dịch nuôi cấy một vài chủng A. xylinum. Nhờ vào
tính dẻo và tính thấm nước của lớp cellulose mà các tế bào vi khuẩn kháng lại được
những thay đổi không thuận lợi trong môi trường sống như giảm lượng nước, thay đổi
pH, xuất hiện các chất độc và các vi sinh vật gây bệnh. Có những ghi nhận rằng
cellulose bao quanh tế bào vi khuẩn bảo vệ chúng khỏi tia cực tím. Khoảng 23% số tế
bào A. xylinum được bao bọc bởi BC sống sót sau 1giờ xử lí bằng tia cực tím. Khi tách
BC ra khỏi tế bào, khả năng sống của chúng giảm đáng kể, chỉ còn 3%.
2.3.

Quá trình tổng hợp sản phẩm:

Khi nuôi cấy vi khuẩn A. xylinum trong môi trường có nguồn dinh dưỡng đầy
đủ (chủ yếu là carbohydrate, vitamin B1, B2, B12… và các chất kích thích sinh
trưởng), chúng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ dinh
dưỡng từ môi trường bên ngoài vào cơ thể, một phần để cơ thể sinh trưởng và phát
triển, một phần để tổng hợp cellulose và thải ra môi trường. Ta thấy các sợi tơ nhỏ
phát triển ngày càng dài hướng từ đáy lên bề mặt trong môi trường nuôi cấy.
Đầu tiên các tế bào Acetobacter xylinum sẽ tiết ra enzyme invertase để thủy phân
đường saccharose thành glucose và fructose. Để thực hiện phản ứng đồng phân hóa, A.
Xylinum tiết enzyme isomerase, chuyển hóa fructose thành glucose.
29

Vi khuẩn tiết ra chất nhầy bao bọc xung quanh chúng, đồng thời hấp thu glucose và
thực hiện các quá trình chuyển hóa tạo thành ba sản phẩm trung gian là glucose-6phosphase, glucose-1-phosphase, UDP-glucose (Uridine diphospho-glucose) dưới tác
dụng lần lượt của ba enzyme là glucokinase, phosphoglucomutase và UDPglucopyrophospholyase:

30

Hình 10. Các phản ứng hoá học trong quá trình tổng hợp cellulose
Tương tự như các thực vật, vi sinh vật có khả năng tổng hợp các oligo và
polysaccharide nội bào, lượng oligo và polysaccharide nội bào đạt tới 60% khối lượng
khô tế bào, còn polysaccharide ngoại bào có thể vượt nhiều lần khối lượng của vi sinh
vật. Thành tế bào cũng chứa một lượng lớn polysaccharide. Tất cả các oligo và
polysaccharide được tổng hợp bằng cách thêm một đơn vị monosaccharide vào chuỗi
saccharide có trước. Đơn vị monosaccharide tham gia phản ứng dưới dạng nucleotide,
monosaccharide được hoạt hóa thường là dẫn xuất của uridin – diphosphat (UDP – X,
đối với A.xylinum thì X là glucose) nhưng đôi khi là các nucleotide purin và pyrimidin
khác. Sự tổng hợp diễn ra theo phản ứng chung sau:
…X-X-X-X

+

UDP-X

=

n nhánh

…X-X-X-X-X

+

UDP

(n+1)nhánh

Từ đó hình thành nên các sợi cellulose và các sợi này sẽ được đưa ra bên ngoài
tế bào, kết hợp với nhau tạo thành các váng cellulose.

31

Hình 11. Cơ chế sinh tổng hợp cellulose
2.4.
Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo màng của vi khuẩn
2.4.1. Hàm lượng các chất
 Nguồn Carbon:
- Là một trong những thành phần quan trọng của môi trường nuôi cấy vi sinh vật.

Nguồn carbon mà A.xylinum có thể sử dụng như: glucose, fructose, glycerol,
-

saccharose…Tuy nhiên, A.xylinum không sử dụng được tinh bột.
Hàm lượng đường của nước dừa là không cao do đó cần bổ sung đường vào để
đảm bảo cơ chất cung cấp cho quá trình sinh trưởng, phát triển và lên men của

-

vi khuẩn.
Tuy nhiên, trong môi trường chứa quá nhiều đường dẫn đến áp suất thẩm thấu

tăng, gây ức chế vi sinh vật. Do đó cần cân nhắc và lựa chọn nồng độ thích hợp.
 Nguồn Nitơ:
- Trong công nghiệp lên men người ta chủ yếu sử dụng nguồn nitơ vô cơ như
-

(NH4)2HPO4 và (NH4)2SO4.
Nếu nồng độ NH4+ quá cao, vi khuẩn không sử dụng hết gây lãng phí. Mặt khác
khi nồng độ quá cao có thể gây ức chế vi sinh vật. Tuy nhiên nếu nồng độ NH 4+
quá thấp khiến cho vi khuẩn không đủ chất dinh dưỡng để sinh trưởng tốt, ảnh
hưởng đến năng suất quá trình lên men.

 Hàm lượng khoáng và các yếu tố sinh trưởng:
32

Tuy chỉ cần một lượng rất nhỏ so với hai thành phần vừa nêu trên nhưng
khoáng và yếu tố sinh trưởng lại rất cần thiết cho vi khuẩn.
2.4.2. Yếu tố môi trường
 pH:
- A.xylinum sinh trưởng ở điều kiện pH nằm trong khoảng 4 đến 5,5 và đạt giá trị

cao nhất ứng với pH = 4,5. Nếu pH quá thấp (pH <3) hay quá cao (pH>7) thì
hầu như A.xylinum không phát triển, điều này ảnh hưởng đến việc sinh trưởng
và tạo màng BC của nó.
Bảng 30. Ảnh hưởng của pH đến quá trình phát triển của A.xylinum
Khả năng phát triển

Thạch tạo được

(ngày)

sau 13 ngày

pH
1
3
3.5
4
4.5
5
5.5
6
6.5
7

2

3

4

Khối lượng
(g)

Độ
dày

(cm)
/
/
+
++
+++
63,83
1,99
+ ++
+++
++++
71,85
2,06
+
+
++
+++
59,09
1,75
+
+
++
++
55,94
1,69
+
+
+
43,4
1,39
+
+
/
/
+
+
/
/
/
/
(-: không phát triển; +: phát triển; /: không hình thành)

Hình 12. Ảnh hưởng của pH đến độ dày của màng BC
33

 Nhiệt độ:
- Nhiệt độ là một yếu tố ảnh hưởng đáng kể đến quá trình lên men.
- Nhiệt độ tối ưu cho quá trình lên men thạch dừa là 28 – 32 0C, ở nhiệt độ này

thạch có khối lượng cao và dày chắc. Khoảng 20 – 25 0C thạch mỏng và mềm
hơn. Nhiệt độ quá thấp (<200C) thạch không hình thành hoặc nếu có hình thành
thì cũng rất chậm.
Bảng 31. Trạng thái thạch dừa phụ thuộc nhiệt độ

Nhiệt độ (0C)

Trạng thái thạch dừa

Khối lượng trung
bình (g) sau 15 ngày

15

Không phát triển

0

20

Màng mỏng – mềm

87,5

25

Trung bình – chắc

128,82

28 – 32

Dày – chắc

195,02

35

Không tạo thành thạch

0

40

Không tạo thành thạch

0

 Hàm lượng oxy:

A.xylinum là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc do đó nó cần cung cấp O2 đầy đủ.
III. Tiêu chí chọn giống nuôi cấy

Để tạo sản phẩm thạch dừa nên chọn vi khuẩn Acetobacter xylinum vì những lý do
sau:
Ở đây ta lựa chọn chủng Acetobacter xylinum BHN2
 Môi trường nuôi cấy chủng Acetobacter xylinum BHN2:

Theo các nghiên cứu thì chủng Acetobacter xylinum BHN2 cho năng suất tạo màng
và chất lượng màng là tốt nhất. Để tạo điều kiện thuận lợi cho chủng vi sinh vật này
34

phát triển thì việc lựa chọn thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy là quan
trọng.
Bảng 32. Thành phần dinh dưỡng của một số môi trường nuôi cấy chủng vi sinh vật
Acetobacter xylinum BHN2
STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

Thành phần
MT1
MT2
MT3
MT4
MT5
Glucose (g)
20
20
20
20
20
(NH4)2SO4 (g)
8
2
2
3
3
(NH4)2HPO4 (g)
2
2
2
2
2
MgSO4.7H2O (g)
2
2
2
2
2
Cao nấm men (g)
5
Pepton (g)
5
Ethanol
2%
Acid acetic
2%
2%
2%
2%
2%
Nước dừa già
1000ml
500ml
Dịch chiết vỏ dứa
200ml
Nước máy
1000ml
800mm
Nước cốt dừa
1000ml
500ml
Khả năng tạo màng của Acetobacter xylinum BHN2 trong các môi trường khác
nhau là khác nhau:

Bảng 33. Khả năng tạo màng của Acetobacter xylinum BHN2 trong các môi trường
khác nhau
Đặc điểm
Thời gian bắt đầu xuất hiện
màng (ngày)

MT1

MT2

MT3

MT4

MT5

2

3

4

3

4

Tính chất của màng

Dai, nhẵn

Dai

Dai

Dai, nhẵn

Không
kết tinh

Màu sắc của màng
Khối lượng của màng (g)
Khả năng chịu lực
Khả năng thấm hút của
màng

Trắng
sáng
3,64
Rất tốt

2,97
Trung bình

3,15
Tốt

3,21
Tốt

1,51
Kém

Rất tốt

Trung bình

Tốt

Tốt

Kém

Trắng ngà

Trắng Vàng ngà

Vàng

Acetobacter xylinum BHN2 được nuôi cấy trong môi trường MT1 có thời gian tạo
sản phẩm nhanh hơn, tính chất màng cellulose tốt hơn (màng dai, nhẵn và khả năng
chịu lực, thấm hút tốt) và màu sắc trắng sáng.
35