Tải bản đầy đủ
1 HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ

1 HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ

Tải bản đầy đủ

HeaderKhóa
Pageluận
15tốt
ofnghiệp
161.

Nguyễn Khánh Toàn

2.3 QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM
Sinh khối nấm tươi (3.5 kg) được làm sạch, để khô, nghiền nhỏ thu được bột
khô (700.0 g). Sau đó, bột khô được ngâm dầm trong ethanol ở nhiệt độ phòng. Lấy
dịch cô quay thu hồi dung môi ở áp suất thấp thu được cao ethanol thô (với khối
lượng 200.0 g).
Cao ethanol thô sẽ được hòa tan nhiều lần trong methanol, tiếp tục cô quay
thu hồi dung môi. Trong quá trình cô quay thu hồi dung môi, thấy xuất hiện kết tủa,
lọc riêng phần kết tủa (70.0 g). Phần dịch methanol thô còn lại 130.0 g. Sau đó tiến
hành sắc ký cột cao methanol thô với hệ dung môi với độ phân cực tăng dần thu
được các phân đoạn tương ứng như Bảng 2.1. Tiến hành sắc kí cột trên 2 phân đoạn
cao A1 và A3 thu được 2 chất là T2 và TT4.
Bảng 2.1 Phân đoạn trên cao methanol thô
Hệ dung môi

Cao

H:EA 9:1
H:EA 8:2
H:EA 7:3
H:EA 5:5
H:EA 7:3
H:EA 9:1
EA:Me 5:5
Me 100%

A1 (1.56 g)
A2 (5.0 g)
A3 (3.1 g)
A4 (10.0 g)
A5 (3.0 g)
A6 (10.0 g)
A7 (30.0 g)
M (56.0 g)

2.3.1 Sắc kí cột trên phân đoạn cao A1
Từ phân đoạn cao A1 (1.56 g) tách riêng phần dầu DA1 (660.0 mg) và phần
tủa TA1 (0.9 g), sau đó tủa TA1 được rửa bằng acetone. Tiếp tục lấy dịch rửa
(200.0 mg) thực hiện sắc ký cột với hệ dung môi H:EA:AcOH (4:1:0.2) thu được
hợp chất T2 có khối lượng 6.0 mg có dạng bột màu trắng.

8

Footer Page 15 of 161.

HeaderKhóa
Pageluận
16tốt
ofnghiệp
161.

Nguyễn Khánh Toàn

2.3.2 Sắc kí cột trên phân đoạn cao A3.4
Cao A3 (3.1 g) được tiến hành sắc kí cột với hệ dung môi H:EA:AcOH
(4:1.0:0.2) thu được 6 phân đoạn kí hiệu từ A3.1 đến A3.6.
Phân đoạn A3.4 (360.0 mg) tiếp tục được sắc kí cột với hệ dung môi C:Me
(5:0.1) thu được hợp chất TT4 có khối lượng 15.0 mg có dạng bột màu trắng.

9

Footer Page 16 of 161.

Header
Page
of 161.
Khóa
luận 17
tốt nghiệp

Nguyễn Khánh Toàn
Sinh Khối Nấm
3.5 kg
- Ngâm dầm trong Ethanol
- Cô quay thu hồi dung môi
Cao Ethanol Thô
200.0 g
Hòa tan trong Methanol nóng
Cao Methanol
130.0 g

Tủa
70.0 g

- SKC (sắc ký cột)
H:EA
[9:1 – 0:10]

A1
1.56 g

A2
5.0 g

A3
3.1 g

A4
10.0 g

EA:Me
[5:5]

A5
3.0 g

Me
100%

A7
30.0 g

A6
10.0 g

M
56.0 g

SKC H:EA:AcOH
4:1:0,2

Dầu (DA1)
660.0 mg

Tủa TA1
900.0 mg

A3.1
150.0 mg

A3.2
70.0 mg

Rửa bằng Ac
nhiều lần

Dịch 660.0 mg

Footer Page 17 of 161.

SKC H:EA:AcOH
4:1:0,2

A3.3
256.0 mg

A3.4
360.0 mg

A3.5
210.0 mg

A3.6
300.0 mg

C:Me
5:0,1

T2
(6.0 mg)

TT4
(15.0 mg)

Sơ đồ 2.1 Quy trình cô lập hợp chất TT4 và T2

10

HeaderKhóa
Pageluận
18tốt
ofnghiệp
161.

Nguyễn Khánh Toàn

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT TT4
 Hợp chất TT4 thu được từ phân đoạn A3.
 Dạng bột màu trắng, không UV.
 Dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) và

13

C-NMR (125 MHz,

DMSO-d 6 ) được trình bày trong Bảng 3.1 (Phụ lục 1,2,3).
 Phổ HSQC, HMBC trong dung môi DMSO-d 6 (phụ lục 4, 5, 6, 7, 8).
 Biện luận cấu trúc hợp chất TT4 (1)
Phổ 1H-NMR cho thấy 6 tín hiệu của các nhóm methyl tại: δ H 0.54 (s, H 3 18), δ H 0.90 (s, H 3 -19), δ H 0.80 (d, H 3 -26), δ H 0.79 (d, H 3 -27), δ H 0.88 (d, H 3 -28),
δ H 1.00 (d, H 3 -21). Trong đó có một nhóm methyl chuyển dịch về vùng từ trường
rất cao tại δ H 0.54 (s, H 3 -18) đặc trưng cho khung sườn sterol.
28
22

21

26

18
12
19 11
1
2

HO

10
5

4

B
6

8

23

25

H
13
14

9

A

3

HC

24

20

H

27

17

D

16

15

7

Hình 3.1 Khung sườn sterol
Trên phổ 1H-NMR xuất hiện 2 tín hiệu ở vùng từ trường thấp của 2 proton
olefin tại δ H 5.24 (dd, J 1 = 15.5 Hz, J 2 = 7.0 Hz) và δ H = 5.20 (J 1 =15.5 Hz, J 2 =
8.0 Hz), phân tích sự chẻ mũi của 2 proton này cho thấy sự tồn tại của 2 proton
olefin ghép trans với nhau ở lân cận với 2 nhóm methine khác, qua đó xác định sự
tồn tại của nối đôi tại C-22, C-23 của khung sườn sterol. Phổ 1H-NMR còn cho thấy
sự hiện diện của nhóm oxymethine H-3 tại δ H 3.77 mũi multiplet đặc trưng cho H-3
khung sterol.

11

Footer Page 18 of 161.

HeaderKhóa
Pageluận
19tốt
ofnghiệp
161.

Nguyễn Khánh Toàn

Phổ 13C-NMR kết hợp phổ HSQC giúp xác định 28 carbon của khung sườn
ergosterol. So sánh tất cả các tín hiệu carbon của hợp chất TT4 với ergosterol [6,
34] cho thấy có sự tương đồng của tất cả các tín hiệu, ngoại trừ tín hiệu carbon của
nhân B, chứng tỏ sự thay đổi nhóm thế của TT4 so với ergosterol chỉ xảy ra trên
vòng B của hợp chất này. Phổ 13C-NMR còn cho thấy ngoài sự xuất hiện của liên
kết đôi tại C-22 và C-23, hợp chất TT4 còn mang một liên kết đôi khác tại C-7 (δ C
119.5) và C-8 (δ C 139.7) trên nhân B.
Trên nhân B, phổ HMBC cho thấy proton 5-OH (δ H 3.63) có sự tương quan
với carbon C-5 (δ C 74.5), C-6 (δ C 72.2) và C-10 (δ C 36.7), proton H 3 -19 (δ H 0.9, δ C
19.8) có sự tương quan với các carbon C-5 (δ C 74.5) và C-10 (δ C 36.7). Ngoài ra
proton 6-OH (δ H 4.50), 5-OH (δ H 3.63) cho tương quan HMBC với C-5, giúp xác
định các vị trí C-5 và C-6 liên kết với oxygen. Bên cạnh đó, tương quan HMBC của
H-7 (δ H 5.10) tới C-5 và C-6 giúp củng cố vị trí của liên kết đôi tại C-7. Từ những
dữ kiện phổ phân tích trên và so sánh với dữ liệu phổ của cerevisterol [1] hợp chất
TT4 được xác định là cerevisterol. Đây là lần đầu tiên cerevisterol được tìm thấy
trong chi Cordyceps.
28

12
1
2
A
HO

3

4

5

20
H

11 13 17D
16
9 C 14

19
10

18

B

8

6

7

H

28

22

21

26
23

24

26

18
19 11

15

1
2

10
5

B

8

25

23

H
13
14

9

A

3

HC

24

20

12

27

HO

OH

22

21

25

H

27

17

D

16

15

7

4
6

OH

Hình 3.2 Tương quan HMBC trên nhân B của hợp chất TT4 (trái) và cấu trúc
ergosterol (phải)

12

Footer Page 19 of 161.