Tải bản đầy đủ
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ

14

RRDR trên gen rpoB. Đột biến trong vùng RRDR ở các chủng kháng
đa thuốc là 94,1%.
- Các vị trí đột biến liên quan kháng rifampicin trên gen rpoB
(n=54): Các vị trí đột biến thường gặp nhất lần lượt là 531 (50%),
526 (29,63%), 516 (9,26%). Các vị trí đột biến mới phát hiện: 530 và
mất đoạn từ codon 511-515.

Mất đoạn 511-515
TGAGCCAATTCA
1

GTC
Val
5

TTG
Leu
1

CTC
Leu
2

ATG TTG
Met Leu
1
23

TAC
Tyr
4
GAC
Asp
3

TGG
Trp
1
TTC
Phe
2

CGC

CAG

Arg
5

Gln
1

CCG
Pro
1

AGC
Ser
1
ACC
Thr
1

Hình 3.2. Số lượng và kiểu đột biến trong vùng RRDR
Có 15 kiểu đột biến ở 7 vị trí riêng biệt. Tại codon 531, kiểu đột
biến TCG → TTG (Ser → Leu) chiếm ưu thế; codon 526 có sự đa
dạng về kiểu đột biến nhất (6 kiểu); chỉ gặp 1 kiểu đột biến GAC →
GTC (Asp → Val) ở codon 516.
- Các kiểu kết hợp vị trí đột biến xảy ra trên đoạn gen rpoB (n=54): Trong
số 54 chủng vi khuẩn lao kháng rifampicin; tỷ lệ chủng mang 1, 2, 3
vị trí đột biến lần lượt là 72,2%; 16,7%; 5,6%; 1 chủng mất đoạn ở
codon 511-515. Các đột biến đơn thường chỉ xuất hiện trong vùng
RRDR của gen rpoB, với các chủng có sự kết hợp nhiều vị trí đột
biến thì đều xuất hiện đột biến trong vùng RRDR của gen rpoB.

15

3.1.3. Đặc điểm phân tử gen katG
Bảng 3.11. Kết quả giải trình tự đoạn 684bp trên gen katG
Chủng vi khuẩn lao
Xác định đột biến
Đặc tính
Số lượng
Đột biến
Không đột
chủng
biến
Nhạy thuốc
10
0
10
Kháng H
59
48 (81,4%)
11 (18,6%)
Tổng số
69
48
21
Trong 59 chủng kháng isoniazid; 48 81,4% chủng đột biến trên
gen katG; 18,6% chủng có kiểu hình kháng isoniazid nhưng không
phát hiện được đột biến trên đoạn 684bp của gen katG.
Bảng 3.12. Tỷ lệ đột biến trong các chủng kháng đơn với isoniazid

Đột biến
Không đột biến
Tổng số

và kháng đa thuốc
Kháng đơn H
Kháng đa thuốc
N
tỷ lệ %
n
tỷ lệ %
6
46,2
42
91,3
7
53,8
4
8,7
13
100
46
100

Tổng số
48
11
59

Tần suất xuất hiện đột biến trên gen katG ở các chủng kháng đa
thuốc cao hơn có ý nghĩa thống kê so với các chủng kháng đơn với
isoniazid (p<0,01).
- Các vị trí và kiểu đột biến trên gen katG (n=59): Có 27 kiểu đột
biến tại 25 vị trí riêng biệt trên đoạn gen katG được giải trình tự. Đột
biến ở codon 315 chiếm tỷ lệ cao nhất (69,5%), tiếp theo là các
codon 309 (5,1%), 327 (5,1%). Các vị trí đột biến khác gặp với tỷ lệ
rất thấp, 1,7% - 3,4% cho mỗi codon.
Bảng 3.15. Tỷ lệ đột biến tại codon 315 trên gen katG
ở các chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid (n=59)
Chủng vi khuẩn lao
Đột biến tại codon 315
Đặc tính
Số lượng chủng
Đột biến
Không đột biến

16

Kháng đơn với H
Kháng đa thuốc
Tổng số

13
46
59

6 (46,2%)
35 (76,1%)
41

7
11
18

Tỷ lệ đột biến ở codon 315 ở các chủng kháng đa thuốc cao hơn ở
các chủng kháng đơn thuốc, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05).
- Số lượng vị trí đột biến trên đoạn gen katG được giải trình tự ở các
chủng lao kháng isoniazid (n=48): tỷ lệ số chủng mang 1, 2, 3, 4 đột
biến lần lượt là 50%; 31,2%; 6,2%; 4,2%; có 02 chủng có nhiều vị trí
đột biến liên tiếp nhưng không có đột biến ở codon 315.

Biểu đồ 3.1. Phân bố số lượng vị trí đột biến theo đặc tính kháng thuốc
Số lượng vị trí đột biến trên các chủng lao kháng thuốc gia tăng
theo số lượng thuốc kháng lao bị kháng. Sự khác biệt về số lượng vị
trí đột biến giữa nhóm kháng đơn với isoniazid và kháng đa thuốc có
ý nghĩa thống kê (p <0,001).
3.2. Giá trị của phương pháp sinh học phân tử trong chẩn đoán
vi khuẩn lao kháng đa thuốc
3.2.1. Đặc tính kháng thuốc của các chủng vi khuẩn lao
- Các kiểu kết hợp kháng thuốc ở các chủng vi khuẩn lao (n=445):
26,1% số chủng vi khuẩn lao kháng đơn thuốc với các thuốc chống
lao dòng 1 (trong đó, chỉ có 3 chủng lao kháng đơn với rifampicin).
Kiểu hình kháng với cả 4 thuốc chống lao chiếm tỷ lệ cao nhất
(53,2%). Số chủng lao kháng đa thuốc chiếm 71,5%.
Bảng 3.20. Kiểu hình đề kháng với rifampicin (n=321)
Kiểu hình đề kháng
Kháng R đơn thuần

N

%

3

0,9

p

17

Kháng R với thuốc khác (MDR)

318

99,1

Tổng cộng

321

100

<0,001

Hầu hết các trường hợp kháng rifampicin là kháng đa thuốc
(99,1%) cao hơn các trường hợp kháng đơn với rifampicin (p<0,001).
3.2.2. Giá trị của phương pháp sinh học phân tử trong chẩn đoán
vi khuẩn lao kháng thuốc
Bảng 3.21. Giá trị của phương pháp sinh học phân tử trong chẩn
đoán vi khuẩn lao kháng rifampicin
Đột biến gen
Kháng sinh đồ
rpoB
Kháng R
Không kháng R
Đột biến
52
0
Không đột biến
2
20
Tổng
54
20

Tổng
52
22
74

Độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị dự báo âm tính, giá trị dự báo dương
tính và độ phù hợp chẩn đoán của phương pháp giải trình tự phát hiện
đột biến gen rpoB và kháng sinh đồ lần lượt là 96,3%; 100%; 90,9%;
100% và 0,934.
Bảng 3.22. Giá trị của phương pháp sinh học phân tử trong chẩn
đoán vi khuẩn lao kháng isoniazid
Đột biến gen
Kháng sinh đồ
katG
Kháng H Không kháng H
Đột biến
48
0

Tổng
48

Không đột biến

11

10

21

Tổng

59

10

69

Độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị dự báo âm tính, giá trị dự báo dương
tính và độ phù hợp chẩn đoán của phương pháp giải trình tự phát hiện

18

đột biến gen katG và kháng sinh đồ lần lượt là: 81,4%; 100%; 47,6%;
100% và 0,559.
Bảng 3.23. Độ nhạy riêng và độ nhạy tích lũy của các vị trí đột biến
so với kiểu hình kháng rifampicin (51 chủng)
và isoniazid (46 chủng) ở các chủng MDR-TB
Vị trí đột biến
Độ nhạy riêng
Độ nhạy
Tần suất Độ nhạy tích lũy
Đột biến liên quan
với kháng R
rpoB531
25/51
49,0%
rpoB526
15/51
29,4%
78,4%
rpoB516
5/51
9,8%
88,2%
Đột biến liên quan
với kháng H
katG315
35/46
76,1%
katG225
1/46
2,2%
78,3%
katG304
1/46
2,2%
80,5%
katG356
1/46
2,2%
82,7%

Độ đặc
hiệu

100%
100%
100%

100%
100%
100%
100%

Với 3 codon đột biến thường gặp trên gen rpoB phát hiện được
88,2% số chủng lao kháng đa thuốc với độ đặc hiệu 100%. Sử dụng
codon đột biến Ser315Thr trên gen katG phát hiện được 76,1% số
chủng lao kháng đa thuốc với độ đặc hiệu 100%, nếu thêm các codon
225, 304, 356 thì tỷ lệ phát hiện tăng lên 82,7%.
- Các đột biến có thể sử dụng phát hiện kháng đa thuốc ở vi khuẩn
lao: Với 3 codon đột biến thường gặp trên gen rpoB (531, 526, 516)
phát hiện được 88,9% chủng lao kháng rifampicin, với codon 315
trên gen katG phát hiện được 69,5% chủng kháng isoniazid.
Với kết quả 74 chủng vi khuẩn lao được giải trình tự đoạn 528bp
trên gen rpoB và 69 chủng thực hiện giải trình tự đoạn 684bp trên

19

gen katG, tất cả có 22 chủng lao kháng đa thuốc được giải trình tự
đồng thời đoạn 528bp trên gen rpoB và đoạn 684bp trên gen katG.
Với codon đột biến thường gặp trên gen rpoB (531, 526, 516) phát
hiện được 86,4% chủng lao kháng đa thuốc; với codon 315 trên gen
katG phát hiện được 77,3% chủng kháng đa thuốc; nếu sử dụng đồng
thời cả 4 codon thường gặp (rpoB531, rpoB526, rpoB516, katG315)
trên hai gen thì phát hiện được 95,5% chủng lao kháng đa thuốc.
Chương 4. BÀN LUẬN
4.1. Đặc điểm phân tử vi khuẩn lao kháng thuốc trên gen rpoB
và katG
4.1.1. Kết quả thu thập và lựa chọn chủng nghiên cứu
Đề tài đã tiến hành thu thập 700 chủng vi khuẩn lao ở 3 bệnh viện
tuyến cuối về vi khuẩn lao đại diện cho 3 miền Bắc, Trung, Nam; các
chủng vi khuẩn sau khi thu thập được làm kháng sinh đồ xác định
tính kháng thuốc để tiếp tục lựa chọn nghiên cứu phân tích đặc điểm
phân tử ở các gen liên quan trên các chủng đại diện. Kết quả giải
trình tự phát hiện đột biến trên gen rpoB và katG là 143 chủng; trong
đó: 30 chủng nhạy cảm với các thuốc chống lao, 54 chủng có kiểu
hình kháng với rifampicin (03 chủng kháng đơn và 51 chủng kháng
đa thuốc), 59 chủng có kiểu hình kháng với isoniazid (13 chủng
kháng đơn và 46 chủng kháng đa thuốc).
4.1.2. Đặc điểm phân tử vi khuẩn lao kháng thuốc trên gen rpoB
4.1.2.1. Số lượng và tỷ lệ đột biến trên gen rpoB ở các chủng vi
khuẩn lao kháng rifampicin
Trong 74 chủng giải trình tự đoạn 528bp trên gen rpoB chứa vùng
RRDR, đột biến trên gen rpoB chỉ xảy ra ở các chủng kháng thuốc.
Với 54 chủng kháng rifampicin, đột biến xuất hiện ở 96,3% số
chủng; phù hợp với nhiều nghiên cứu tại Kazakhtan, Ai Cập. Điều

20

này cho thấy đột biến chỉ xảy ra ở các chủng vi khuẩn kháng thuốc,
đây chính là cơ sở cho việc áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử chẩn
đoán lao kháng thuốc.
Kháng đơn với isoniazid thường gặp còn kháng rifampicin đơn
thuần rất hiếm gặp, thường trên 90% số chủng lao kháng với
rifampicin kết hợp với kháng isoniazid, nghĩa là kháng đa thuốc. Sự
đề kháng với rifampicin là một dấu hiệu chỉ điểm có giá trị cho
kháng đa thuốc và là kết quả của đột biến trên gen rpoB, gen mã hoá
cho tiểu đơn vị β của RNA polymerase. Kết quả của chúng tôi cũng
khẳng định điều đó, rằng các chủng xuất hiện đột biến trên gen rpoB
chỉ xảy ra ở các chủng kháng với rifampicin và tuyệt đại đa số là các
chủng kháng đa thuốc (94,4%). Chúng tôi chỉ gặp 3/54 chủng kháng
đơn với rifampicin. Như vậy đột biến trên gen rpoB là đặc trưng của
kháng đa thuốc.
4.1.2.2. Các vị trí đột biến trên gen rpoB ở các chủng vi khuẩn lao
kháng rifampicin
Tỷ lệ đột biến cao nhất gặp ở các codon 531, 526 và 516 (50%,
29,63% và 9,26%); tương tự như kết quả của các nghiên cứu trên thế
giới. Điều này cho thấy rằng các đột biến tại vị trí 531/526/516 là
thường gặp nhất trên gen rpoB mặc dù những sự thay đổi liên quan
đến tần suất đột biến trên những codon này được mô tả đối với chủng
vi khuẩn lao từ những vị trí địa lý khác nhau. Đột biến tại vị trí các
codon 516/526/531 trong vùng RRDR thường gặp nhất ở các chủng
vi khuẩn lao kháng đa thuốc. Phần lớn các đột biến ở ngoài vùng
RRDR thường đi kèm với các đột biến trong vùng RRDR ở codon
531, 526 và 516.

21

4.1.2.3. Tỷ lệ và kiểu đột biến trong vùng RRDR trên gen rpoB
51 chủng vi khuẩn lao kháng rifampicin (94,4%) có đột biến
trong vùng RRDR của gen rpoB, cũng nằm trong kết quả chung trên
thế giới; trong đó, số chủng lao kháng đa thuốc chiếm 94,1%. Như
vậy đa số các chủng có đột biến trong vùng này là chủng kháng đa
thuốc. Điều này càng khẳng định rằng đột biến trong vùng RRDR
trên gen rpoB của các chủng vi khuẩn lao có liên quan mật thiết với
tính kháng đa thuốc. Trong vùng RRDR của gen rpoB, có 15 kiểu đột
biến khác nhau, trong đó codon 526 có 6 kiểu đột biến, codon 531 có
4 kiểu đột biến; tương tự như nghiên cứu của Cavusoglu (Thổ Nhĩ
Kỳ). Tại codon 531, đột biến dẫn đến sự thay thế axit amin Serine →
Leucine (TCG → TTG) chiếm ưu thế (42,59%). Đây cũng là kiểu đột
biến được phát hiện nhiều nhất trong các nghiên cứu và có liên quan
đến đề kháng với rifampicin ở mức độ cao trên thế giới.
4.1.2.4. Các vị trí và kiểu đột biến mới trên gen rpoB ở các chủng vi
khuẩn lao kháng rifampicin
Đó là vị trí đột biến 530, và 1 đột biến mất đoạn gồm 12 nucleotit
từ codon 511 đến codon 515, đều gặp ở các chủng kháng đa thuốc,
kiểu đột biến chủng này cần tiếp tục nghiên cứu thêm. Đây là 2 kiểu
đột biến chưa thấy tác giả nào trong nước cũng như trên thế giới công
bố. Có thể đây là những đặc điểm riêng biệt của các chủng vi khuẩn
lao kháng rifampicin phân lập từ Việt Nam, để khẳng định thì cần có
các nghiên cứu thêm trên số lượng chủng nhiều hơn. Như vậy, ngoài
các codon đột biến thường gặp trên gen rpoB, tùy thuộc vào từng
vùng, từng khu vực lại xuất hiện thêm một số vị trí đột biến mới.
4.1.2.6. Các kiểu kết hợp vị trí đột biến
72,2% chủng lao kháng rifampicin có xuất hiện đột biến đơn tại 1
codon, các codon này hầu hết đều nằm trong vùng RRDR và tập

22

trung vào 3 codon thường gặp 531, 526 và 516. Số chủng mang nhiều
vị trí đột biến riêng biệt đều là các chủng kháng đa thuốc và bao giờ
cũng đi kèm đột biến tại codon nằm trong vùng RRDR của gen rpoB.
Điều này càng khẳng định rằng đột biến trong vùng RRDR trên gen
rpoB có vai trò quan trọng quyết định tính kháng rifampicin đặc biệt
là kháng đa thuốc ở các chủng vi khuẩn lao phân lập tại Việt Nam.
Tóm lại, những đột biến trên gen rpoB phát hiện trong nghiên cứu
của chúng tôi được so sánh với các nghiên cứu từ những khu vực
khác nhau trên thế giới, đặc biệt là những đột biến thường gặp, phản
ánh bức tranh toàn cảnh của thế giới về vi khuẩn lao kháng thuốc,
đặc biệt là kháng đa thuốc. Đó là đột biến thay thế amino axit tại
phần Ser531, His526 và Asp516 chiếm ưu thế ở Việt nam và các
nước khác.
4.1.3. Đặc điểm phân tử vi khuẩn lao kháng thuốc trên gen katG
4.1.3.1. Số lượng và tỷ lệ đột biến trên gen katG ở các chủng vi
khuẩn lao kháng Isoniazid
Kết quả ở bảng 3.11 cho thấy, 81,4% chủng lao kháng với
isoniazid có xuất hiện đột biến trên đoạn gen katG được giải trình tự,
tương tự như nghiên cứu trên thế giới và trong nước. Như vậy đột
biến trên gen katG có liên quan đến tính kháng isoniazid ở các chủng
vi khuẩn lao. Tuy nhiên, có 18,6% chủng không phát hiện thấy đột
biến trên vùng gen katG được giải trình tự, nhưng đều có kiểu hình
kháng isoniazid. Có thể các đột biến dẫn đến kháng isoniazid còn xảy
ra bên ngoài vùng gen katG được giải trình tự hoặc xảy ra trên các gen
có liên quan kháng isoniazid khác mà chưa được thực hiện trong
nghiên cứu này như gen inhA, kasA, ....

23

4.1.3.2. Đột biến ở codon 315 trên gen katG (315katG)
Vị trí đột biến trên đoạn gen katG thường gặp nhất là codon 315
(69,5%), trong đó đa số các chủng là kháng đa thuốc. Kết quả của
chúng tôi cũng nằm trong tỷ lệ phân bố chung của đột biến 315katG
ở các vùng có tỷ lệ lưu hành bệnh lao cao trên thế giới. Như vậy,
codon đột biến này là một dấu ấn quan trọng của sự đề kháng với
isoniazid. Ở codon đột biến này, chúng tôi chỉ gặp duy nhất 1 kiểu
đột biến thay thế Ser315Thr (AGC →ACC). Đây cũng là kiểu thay
thế axit amin duy nhất tìm thấy trong nghiên cứu của Abdelaal (Ai
Cập), Kozhamkulov (Kazakhstan). Những kết quả của chúng tôi có
thể đóng góp vào việc thiết kế các xét nghiệm phân tử để phát hiện
kháng isoniazid và kháng đa thuốc ở vi khuẩn lao. Đột biến katG
Ser315Thr có thể được sử dụng như một marker cho sàng lọc nhanh
các chủng lao kháng isoniazid và kháng đa thuốc.
4.1.3.4. Tỷ lệ đột biến ở các chủng kháng đơn với isoniazid và
kháng đa thuốc
Tần suất xuất hiện đột biến trên gen katG (đặc biệt là đột biến
katG315) ở các chủng kháng đa thuốc cao hơn so với các chủng
kháng đơn với isoniazid (p<0,01). Các nghiên cứu khác trên thế giới
trước đây với khoảng 78-94% số chủng vi khuẩn lao kháng đa thuốc
có mang đột biến này. Điều này càng khẳng định rằng, đột biến
katG315 xảy ra thường xuyên hơn ở các chủng kháng đa thuốc. Và
cho thấy rằng đột biến trên gen katG là đặc trưng cho lao kháng đa
thuốc.
4.1.3.5. Số lượng vị trí đột biến trên đoạn gen katG được giải trình tự
Biểu đồ 3.1. cho thấy số chủng có nhiều vị trí đột biến chiếm tỷ lệ
cao hơn ở các chủng lao kháng đa thuốc so với các chủng kháng đơn
với isoniazid (p<0,001). Các chủng xuất hiện nhiều vị trí đột biến

24

thường là đột biến ở codon 315 đi kèm với đột biến ở các codon khác.
Điều này càng khẳng định rằng khi xuất hiện đột biến trên gen katG,
các chủng vi khuẩn lao có sức đề kháng cao hơn có thể tồn tại được
trong môi trường có thuốc kháng sinh, tiếp tục lan truyền và trở nên
kháng đa thuốc. Đồng thời dưới áp lực chọn lọc của thuốc, các chủng
lao này lại tiếp tục tích luỹ các đột biến thêm vào dẫn tới xuất hiện
thêm nhiều codon đột biến khác nhau trên cùng 1 chủng.
4.2. Giá trị của phương pháp sinh học phân tử trong chẩn đoán
vi khuẩn lao kháng đa thuốc
4.2.1. Đặc tính kháng thuốc của các chủng vi khuẩn lao thu thập được
Trong 445 chủng vi khuẩn lao kháng thuốc, 318 chủng (71,5%)
kháng đa thuốc. Có sự kết hợp giữa kháng rifampicin với các thuốc
khác - kháng đa thuốc, cao hơn so với kháng rifampicin đơn thuần
(p<0,001). Điều này càng cho thấy rằng kháng rifampicin là một dấu
hiệu có giá trị thay thế cho kháng đa thuốc và chỉ ra rằng thuốc chống
lao dòng II cần được sử dụng khẩn cấp trong trường hợp này.
4.2.2. Giá trị của phương pháp sinh học phân tử trong chẩn đoán
vi khuẩn lao kháng đa thuốc
Độ nhạy trong phát hiện kháng rifampicin của chúng tôi là 96,3%;
kháng isoniazid là 81,4%; tương tự như các nghiên cứu khác trên thế
giới và Việt Nam. Do cơ chế phân tử của tính kháng rifampicin tập
trung vào gen rpoB, đặc biệt là vùng RRDR nên khả năng phát hiện
tính kháng rifampicin của phương pháp giải trình tự gen rpoB cao.
Do đột biến dẫn đến kháng isoniazid xảy ra ở một loạt các gen khác
nhau, vì vậy khả năng phát hiên kháng thuốc dựa trên đột biến trên
gen katG còn nhiều hạn chế. Chúng tôi đề nghị trong nghiên cứu tiếp
theo cần xác định thêm đột biến trên gen inhA liên quan kháng
isoniazid. Độ đặc hiệu của phương pháp trong xác định lao kháng