Tải bản đầy đủ
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ

9

2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Các chủng vi khuẩn lao được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm
thu thập từ 3 bệnh viện: Bệnh viện Phổi Trung Ương, Bệnh viện Đa
khoa Trung ương Huế, Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch - thành phố Hồ Chí
Minh trong thời gian 2008-2009.
- 143 chủng vi khuẩn lao giải trình tự phát hiện đột biến trên gen
rpoB và katG , trong đó: 30 chủng nhạy cảm với các thuốc chống lao;
54 chủng có kiểu hình kháng với rifampicin (03 chủng kháng đơn với
rifampicin và 51 chủng MDR); 59 chủng có kiểu hình kháng với
isoniazid (13 chủng kháng đơn với isoniazid và 46 chủng MDR).
2.2. Địa điểm nghiên cứu
Bệnh viện Phổi Trung ương, Bệnh viện Đa khoa Trung ương Huế,
Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch - TP Hồ Chí Minh, Học viện quân Y,
Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Viện Công nghệ sinh học.
2.3. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu
2.3.1. Vật liệu: Các sinh phẩm, hóa chất dùng tách chiết DNA vi
khuẩn lao, tách dòng và giải trình tự gen...
2.3.2. Thiết bị: tách chiết DNA vi khuẩn lao, tách dòng và giải trình
tự gen...
2.3.3. Các cặp mồi dùng trong nghiên cứu
Các cặp mồi đặc hiệu được sử dụng cho phản ứng PCR có trình tự
tương ứng như sau:
Sản phẩm
Gen đích Mồi
Trình tự
PCR (bp)
rpoB-F 5’-ACC GAC GAC ATC GAC CAC TT-3’
rpoB_seq rpoB528
5’- GGC GGT CAG GTA CAC GAT CT-3’
R
katG-F 5’ GAG CCC GAT GAG GTC TAT TG 3’
katG_seq
684
katG-R 5’ GTC TCG GTG GAT CAG CTT GT 3’

10

2.3.4. Phần mềm: Phân tích kết quả giải trình tự bằng phần mềm
BioEdit.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Thiết kế nghiên cứu
Tiến hành nghiên cứu bằng phương pháp mô tả cắt ngang và
phương pháp thực nghiệm labo có đối chứng.
2.4.2. Phương pháp thu thập số liệu
- Các số liệu về tính kháng thuốc được thu thập và làm kháng sinh
đồ bổ sung tại Bệnh viện Phổi Trung Ương và Bệnh viện Phạm Ngọc
Thạch -TP Hồ Chí Minh.
- Kỹ thuật tách chiết DNA của các chủng vi khuẩn lao được thực
hiện tại Học viện quân Y.
- Thực hiện kỹ thuật giải trình tự phân tích đặc điểm phân tử gen
rpoB được tiến hành tại Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, gen katG
tại Viện công nghệ sinh học.

11

Sơ đồ nghiên cứu

2.5. Kỹ thuật xét nghiệm
2.5.1. Kỹ thuật kháng sinh đồ phát hiện vi khuẩn lao kháng thuốc
Được thực hiện tại Bệnh viện Phổi Trung Ương và Bệnh viện
Phạm Ngọc Thạch TP Hồ Chí Minh theo quy trình thống nhất của
Chương trình chống lao Quốc gia.
2.5.2. Tách chiết DNA từ các chủng vi khuẩn nghiên cứu
2.5.3. Kỹ thuật PCR nhân đoạn DNA
* Phản ứng PCR nhân đoạn gen rpoB và katG:
Khuếch đại DNA trên gen rpoB (sản phẩm PCR có chiều dài 528
bp, chứa vùng RRDR của gen rpoB) và khuếch đại DNA trên gen
katG (sản phẩm PCR có chiều dài 684 bp, chứa vị trí codon 315 của
gen katG) với cặp mồi đặc hiệu.
2.5.4. Tách dòng gen rpoB và katG phục vụ cho giải trình tự
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được đưa vào plasmid vector
tách dòng plasmid pGEM®-T hoặc pBT, sau đó được biến nạp vào tế
bào khả biến E. coli DH5α. Sản phẩm biến nạp sau đó được cấy trải
trên môi trường LB Agar có bổ sung kháng sinh chọn lọc ampicilin,
chọn những khuẩn lạc màu trắng là những khuẩn lạc của vi khuẩn

12

mang plasmid tái tổ hợp. DNA plasmid tái tổ hợp được tách chiết và
kiểm tra sự có mặt của đoạn gen chèn vào plasmid (đoạn gen rpoB có
kích thước 528bp và đoạn gen katG có kích thước 684 bp).
2.5.5. Phương pháp đọc trình tự DNA theo Sanger trên máy đọc
trình tự tự động phân tích kết quả bằng các phần mềm
chuyên dụng
Sử dụng nguyên liệu là lượng gen rpoB và gen KatG, tiếp tục giải
trình tự bằng máy phân tích trình tự DNA ABI 3130XL-Avant. Xử lý,
phân tích các trình tự đoạn gen rpoB và katG của các chủng vi khuẩn lao
bằng phần mềm BioEdit từ đó phân tích rút ra các đặc điểm phân tử của
các chủng vi khuẩn lao kháng đa thuốc ở Việt Nam.
2.6. Xác định giá trị của phương pháp sinh học phân tử trong
chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc.
Coi kết quả kháng sinh đồ là tiêu chuẩn vàng; tính độ nhạy, độ
đặc hiệu, giá trị dự báo âm tính, giá trị dự báo dương tính và độ phù
hợp (chỉ số Kappa) giữa phương pháp sinh học phân tử và kháng sinh
đồ trong phát hiện lao kháng thuốc theo bảng dưới đây:
Giải trình tự gen
Kháng sinh đồ (chuẩn vàng)
Cộng theo PP
rpoB (katG)
giải trình tự gen
Kháng R (H) Không kháng R (H)
rpoB (katG)
Đột biến
a
b
a+b
Không đột biến
c
d
c+d
Cộng theo PP kháng
a+c
b+d
n=a+b+c+d
sinh đồ
2.7. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
- Các số liệu được quản lý và phân tích bằng chương trình SPSS 13.0
- Test χ2được sử dụng để đánh giá sự khác biệt giữa hai tỷ lệ.
- Giá trị p<0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê.