Tải bản đầy đủ
Trong khu vực nghiên cứu tại các vị trí địa hình như chân, sườn, đỉnh; hướng phơi, loài cây, tuổi cây...chúng tôi lập các ô tiêu chuẩn đại diện để điều tra, diện tích mỗi ô tiêu chuẩn là 1000 m2 (40mx25m), dung lượng mẫu điều tra đủ lớn n ( 30). Sau ...

Trong khu vực nghiên cứu tại các vị trí địa hình như chân, sườn, đỉnh; hướng phơi, loài cây, tuổi cây...chúng tôi lập các ô tiêu chuẩn đại diện để điều tra, diện tích mỗi ô tiêu chuẩn là 1000 m2 (40mx25m), dung lượng mẫu điều tra đủ lớn n ( 30). Sau ...

Tải bản đầy đủ

15

Chụp ảnh và quan sát bằng mắt thường mô tả các Biểu hiện bên ngoài
như: màu sắc lá, tình trạnh thân, rễ.
Lấy mẫu rễ quan sát trên kính soi nổi, mô tả các triệu chứng như: thối,
loét…(nếu có)
- Phân lập trực tiếp từ rễ:
Chọn những rễ con có cả phần khỏe và phần bị bệnh, rửa bằng nước vô trùng
nhiều lần, nhúng qua các rễ con trong cồn 70%, rửa nhanh và hơ khô trên đèn
cồn. Dùng dụng cụ đã khử trùng cắt rễ thành từng miếng dài 1-2mm ở phần
ranh giới giữa mô khỏe và mô bệnh sau đó cấy lên môi trường PDA và môi
trường trường CMA (Corn Meal Agar) có kháng sinh NARPH ((Nilstat 1ml;
Ampicillin 0.1g; Rifadin 0.5ml; Terraclor (PCNB) 0.1g; Hymexazol
0.05g))/lít). [40], [41].
Đặt đĩa cấy ở nhiệt độ khoảng 25oC và quan sát hàng ngày dưới kính
lúp soi nổi để kiểm tra nấm mọc từ các miếng rễ cây.
Cấy truyền từng tản nấm lên môi trường PDA hoặc môi trường CMA.
Làm thuần nấm bằng cách cấy đỉnh sinh trưởng của sợi nấm.
- Phương pháp bẫy đất:
Đây là phương pháp chọn lọc bởi vì nó thích hợp cho việc phân lập các
loài sản sinh ra du động bào tử.
+ Cho khoảng 200g đất vào một hộp nhựa
+ Đổ nước vô trùng hoặc nước cất vào hộp đựng sao cho ngập đất khoảng
5-10cm.
+ Để lắng và vớt sạch rác nổi trên bề mặt nước
+ Thả vào hộp nhựa những lá non, tươi của cây trồng mẫn cảm với các bệnh,
các vật liệu bẫy này sẽ nổi trên mặt nước (Hình 2-1).
+ Đặt cốc nguyên vị trí trong vòng 2-4 ngày.
+ Phân lập nấm sau 1-3 ngày từ mép vết bệnh đã phát triển trên vật liệu bẫy

16

sau khi rửa trong nước vô trùng và khử trùng bề mặt, dùng môi trường
NARPH để phân lập. Đặt đĩa cấy ở nhiệt độ khoảng 25oC, cấy truyền từng tản
nấm lên môi trường PDA hoặc môi trường CMA. Làm thuần nấm bằng cách
cấy đỉnh sinh trưởng của sợi nấm.
Vật liệu có thể dùng để bẫy bao gồm lá cà ổi, lá cây có múi, lá đỗ
quyên, lá keo....

Hình 2-1: Bẫy đất
- Giám định loài nấm gây bệnh
Dựa vào đặc điểm hình thái, giải phẫu của bào tử áo (Chlamydospore),
bào tử noãn (Oogonia) và túi bào tử động (Sporangia), định loại nấm dựa trên
hai khóa phân loại nấm thuộc 2 chi Phytophthora và Pythium sau: chuyên
khảo về Phytophthora của Hamm B.P. and Hansen M.E. (1987).[47]; chuyên
khảo về Chi Pythium” của Plaats-Niterink A. J. van der (1981) [57].
Định loại nấm gây bệnh cũng được thực hiện dựa trên kỹ thuật sinh học
phân tử, cụ thể như sau:
- Tách chiết AND: Nghiền mẫu: mẫu nấm đựng trong ống ependoff 2,0ml,
cho 1 thìa hạt thủy tinh và lắc trong máy lắc từ 1 dến 2 phút; cho vào bột mẫu
vừa nghiền 400l dung dịch AP1; cho tiếp 4 l RnaseA và lắc đều trên máy

17

votex; ủ nóng dung dịch mẫu ở 650C trong 10 phút; thêm vào dung dịch mẫu
dung dịch đệm 130l AP2; ly tâm ở 14.000 vòng/phút trong 5 phút; lấy 400
l dung dịch mẫu sang ống ependoff mới; thêm 1,5 thể tích dung dụng đệm
AP3 vào ống chứa 400 l dung dịch mẫu (600 l dung dịch AP3); lấy 650 l
dung dịch mẫu vào cột lọc DNeasy Mini Spin Column, ly tâm ở 8000 vòng
phút trong 1 phút, đổ bỏ dung dịch chảy qua màng lọc, lấy tiếp dung dịch mẫu
còn lại vào cột lọc DNeasy Mini Spin Column, ly tâm ở 8000 vòng phút trong
1 phút; đặt cột lọc DNeasy Mini Spin Column vào ống ly tâm mới và lấy
500l dung dịch đệm AW đổ trên cột lọc để rửa ADN và ly tâm ở 8000 vòng
phút trong 1 phút, đổ bỏ dung dịch chảy qua màng lọc; thêm 500l dung dịch
vào cột lọc để tiếp tục rửa ADN trên màng lọc, ly tâm ở 14000 vòng phút
trong 2 phút, ADN nằm trên màng lọc của cột lọc DNeasy Mini Spin Column;
chuyển cột lọc sang ống ependoff mới, ghi ký hiệu mẫu và dùng 50 l dung
dịch đệm AE đổ vào cột lọc DNeasy Mini Spin Column, ly tâm ở 8000 vòng
phút trong 1 phút; thu ADN đã chảy từ cột lọc vào ống ependoff.
- Quy trình PCR: Hóa chất và công thức cho PCR đối với 1 ống ependoff
nhỏ: nước không ion (14l), 10x EX Taq buffer (2l), dNTP mix (2l),
primer 1- ITS1 10M (0,5l), primer 2-ITS4 10M (0,5l), EX taq (0,1l).
Tất cả các hóa chất trên được lấy 1 lượng gấp 9 lần cho vào 1 ống ependoff
với tổng số 172l gồm các thành phần sau: nước (126l), 10x EX Taq
buffer (18l), dNTP mix (18l), primer 1 (ITS1) (4,5 l) ), primer 2 (ITS4)
(4,5 l), EX taq (1l). Lấy 19 l từ ống ependoff chứa 172 l cho vào 8 ống
ependoff. Thêm 1 l ADN cần thực hiện phản ứng PCR của từng mẫu vào
từng ống. Đánh số 1 đến 8. Ống ependoff từ 1 đến 7 chứa ADN còn ống thứ 8
là đối chứng. Chạy phản ứng PCR trên máy với quy trình: bước 1: cycle 1
(1x)ở 950C trong 03.00 phút; bước 2: cycle 1 (40x) ở 950C trong 00.30phút;

18

bước 2: ở 500C trong 00.30 phút; bước 3: ở 720C trong 01.00 phút; bước 1:
Cycle 3 (1x) ở 720C trong 05.00 phút; bước 1: cycle 1 (1x) ở 150C trong 10.00
phút.
- Quy trình chạy điện di: pha bản thạch: bản thạch 1% Agarose S (1 gam
Agarose S + 99 ml TAE), đun chảy thạch, để nguội 500C đổ trên bản khuôn
đã cắm lược; để nguội thạch, rút lược và đặt khay thạch vào máy điện di đã đổ
dung dịch ATE, chiều lỗ lược quay về phía cực âm, cho 2l dung dịch đánh
dấu vào lỗ lược 1. ADN của các mẫu được lấy 1.5 l trộn vói 1 l chất nhuộm
cho vào các lỗ lược, lỗ lược thứ 8 là đối chứng không có DNA; chạy chương
trình 22 phút ở 100V, nhúng trong dung dịch dịnh hình và quan sát ADN trên
bản thạch dưới ánh sáng tử ngoại, những mẫu có ADN đủ lớn để sequencing
phải thể thiện trên bản gel.
- Đọc trình tự AND và định loại các chủng nấm: Trình tự AND được đọc
bằng phương pháp “Dideoxy Chain Termination”. Sử dụng máy đọc trình tự
model 377 của hãng Applied Biosystem. Sữa chữa chuỗi AND bằng phần
mền BioEdit. Các chuỗi AND của các mẫu nấm được so sánh với chuỗi AND
trên ngân hàng gen thông qua giao diện tìm kiếm Blast (Basic Local
Alignment Search Tool) trên website: http://ncbi.nlm.nih.gov.
2.5.3. Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vật gây bệnh
trong phòng thí nghiệm
2.5.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ sinh trưởng và phát
triển của khuẩn lạc
Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường dinh dưỡng PDA, đặt trong
tủ định ôn có các mức nhiệt độ khác nhau. Phương pháp thí nghiệm được tiến
hành như sau:

19

Đổ môi trường dinh dưỡng PDA đã nấu vào đĩa petri được khử trùng
dầy 2 – 3 mm, để nguội cho môi trường đông cứng lại, cấy giống nấm đã
được phân lập từ 10 – 12 ngày tuổi vào chính giữa hộp lồng rồi băng lại cho
kín. Xếp các hộp lồng vào tủ định ôn có nhiệt độ: 15oC± 1; 200C ± 1; 250C ±
1; 300C ± 1; 350C ± 1, mỗi tủ đặt 2 hộp lồng. Đo đường kính của khuẩn lạc
theo hai chiều vuông góc, lấy trị số trung bình và đo ở ngày thứ 3 - 6. Thí
nghiệm được lập lại 2 lần và lấy trị số bình quân làm đại diện cho thí nghiệm.
2.5.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm đến tốc độ sinh trưởng và phát
triển của khuẩn lạc
Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Both.C. Dung dịch
NaCl được pha với các nồng độ khác nhau trong bình hút ẩm tạo cho chúng
ta có được các độ ẩm như sau:
NaCl (g/lít)
RH%

0

16

32

48

64

100

90

80

70

60

Dung dịch pha xong đổ vào bình hút ẩm loại lớn, đậy nắp lại để ở
phòng thí nghiệm, trong tối có nhiệt độ không khí khoảng 23 - 270C. Sau 3
ngày trong các bình hút ẩm khác nhau sẽ có độ ẩm không khí khác nhau, phụ
thuộc vào nồng độ của NaCl, khi nồng độ của NaCl càng lớn thì độ ẩm của
môi trường càng nhỏ và ngược lại nồng độ của NaCl càng nhỏ thì độ ẩm của
môi trường càng lớn. Môi trường PDA sau khi hấp khử trùng được đổ vào
hộp lồng đã được khử trùng một lớp dày 2 - 3 mm. Cấy giống nấm đã được
phân lập từ 10 - 12 ngày tuổi vào chính giữa hộp lồng bằng que cấy.Đặt hộp
lồng vào các bình hút ẩm có độ ẩm không khí khác nhau, mỗi bình ta đặt 2
hộp. Sau 3 ngày lấy hộp lồng đo đường kính khuẩn lạc theo hai chiều vuông
góc, lấy trị số bình quân của các hộp lồng đặt trong mỗi bình hút ẩm. Thí
nghiệm được lặp lại 2 lần.