Tải bản đầy đủ
Các kỹ thuật di truyền tế bào

Các kỹ thuật di truyền tế bào

Tải bản đầy đủ

Các kỹ thuật chẩn đoán di truyền
Xử lý và nhuộm tế bào để quan sát NST với cấu trúc băng;
Quan sát, chụp hình, đếm, sắp xếp và phân tích.
Thông tin từ kết quả
Nhiễm sắc thể đồ cho phép chúng ta khảo sát tổng quát toàn bộ bộ NST, phát hiện
các bất thường số lượng NST, các bất thường cấu trúc như chuyển đoạn, đảo đoạn,
NST đều, các mất đoạn và nhân đoạn lớn (thông thường trên 2 Mb).
Hạn chế
Không thể đem lại thông tin về các bất thường cấu trúc nhỏ hơn 2 Mb, các
bất thường về mythyl hóa (trường hợp dấu ấn di truyền), các bệnh lý gien...
Thời gian thực hiện xét nghiệm dài.
Có thể thất bại trong nuôi cấy.
Có khả năng nhiễm tế bào mẹ gây sai lệch chẩn đoán.
Đây là xét nghiệm di truyền cơ bản và quan trọng, sẽ được trình bày chi tiết trong
phần II .
b. Lai huỳnh quang tại chỗ: FISH (Fluorescence in situ hybridization)
Nguyên lý
Dựa trên sự bắt cặp giữa các base bổ sung, một đoạn DNA có thể được tổng hợp và
đánh dấu huỳnh quang (gọi là đoạn mồi), trước khi cho tiếp xúc với NST cần khảo
sát. Trong những điều kiện thích hợp, đoạn mồi sẽ bắt cặp với vùng tương ứng trên
NST cần khảo sát (gọi là phản ứng lai).
Tín hiệu huỳnh quang sẽ được quan sát nhằm xác định tình trạng:
bình thường (có 2 tín hiệu huỳnh quang, tương ứng với vùng cần khảo sát
trên 2 NST ;
mất đoạn: mất 1 hay 2 tín hiệu, hoặc có trường hợp chỉ giảm cường độ tín
hiệu (khi mất đoạn nhỏ hơn kích thước đoạn mồi). Trường hợp monosomy,
cũng quan sát thấy mất một tín hiệu;
nhân đoạn: có tín hiệu thứ 3, thứ 4... Trường hợp trisomy cũng quan sát thấy
3 tín hiệu;
chuyển đoạn: tín hiệu được phát hiện trên một NST khác.
Vùng cần khảo sát được xác định dựa vào:
những triệu chứng lâm sàng hướng chẩn đoán đến một bệnh lý mà bất
thường trên NST đã được mô tả rõ;
bất thường cấu trúc (mất đoạn, nhân đoạn, đảo đoạn, chuyển đoạn, NST đều)
được quan sát thấy trên NST đồ nhưng cần được khẳng định lại.
106

Các kỹ thuật chẩn đoán di truyền
Phương pháp
Theo nguyên lý trên, việc thực hiện kỹ thuật FISH gồm các bước:
Tổng hợp đoạn mồi tương ứng với vùng cần khảo sát;
Đánh dấu huỳnh quang đoạn mồi (có thể đánh dấu bằng nhiều màu huỳnh
quang trong trường hợp lai cùng lúc nhiều loại mồi khác nhau);
Thực hiện phản ứng lai;
Rửa đi các đoạn mồi thừa không gắn vào vùng cần khảo sát, cố định tiêu
bản, quan sát, chụp hình, phân tích.
Thông tin từ kết quả
Khi đã có được hình chụp các cụm NST kỳ giữa lai với đoạn mồi, công việc còn lại
chỉ là đếm số lượng các tín hiệu nhằm xác định các chẩn đoán mất đoạn, nhân
đoạn, trisomy, monosomy. Vị trí tương đối của các tín hiệu có màu huỳnh quang
khác nhau (ví dụ: đoạn mồi đặc hiệu màu đỏ, đoạn mồi cho các telomere màu xanh)
có thể khẳng định các chẩn đoán chuyển đoạn, đảo đoạn.
Hạn chế
Chỉ đem lại thông tin liên quan đến vùng cần khảo sát.
Chỉ có thể phát hiện các mất đoạn, nhân đoạn lớn hơn 10 Kb.
c. Nhuộm toàn bộ NST (Chromosome painting)
Nguyên lý
Cùng nguyên lý với kỹ thuật FISH, nhưng sử dụng nhiều đoạn mồi lai trên suốt
chiều dài của một NST.
Phương pháp
Tương tự nhưkỹ thuật FISH.
Thông tin từ kết quả
Với toàn bộ NST phát huỳnh quang, các chuyển đoạn được quan sát rõ ràng, cũng
như các trường hợp một đoạn NST chènvào giữa NST khác.
Kỹ thuật này đặc biệt hữu ích trong các trường hợp chuyển đoạn không rõđiểm gãy
(do đó không chọn được đoạn mồi đặc hiệu như trong kỹ thuật FISH).
Hạn chế
Giá thành khá cao và thông tin thu được hạn chế (không phát hiện được đảo đoạn,
mất đoạn...)
107

Các kỹ thuật chẩn đoán di truyền
d. NST đồ quang phổ (spectral karyotype)
Nguyên lý
Cùng nguyên lý với kỹ thuật FISH và kỹ thuật Nhuộm toàn bộ NST, nhưng sử dụng
các bộ mồi nhuộm khác màu huỳnh quang cho mỗi NST khác nhau.
Phương pháp
Tương tự như kỹ thuật FISH.
Thông tin từ kết quả
Phát hiện chuyển đoạn, chèn đoạn tương tự như kỹ thuật Nhuộm toàn bộ NST.
Đặc biệt kỹ thuật NST đồ quang phổgiúp nhận ra nhanh chóng nguồn gốc của NST
marker, giúp khảo sát các trường hợp bất thường cấu trúc NST phức tạp, liên quan
đến nhiều cặp NST khác nhau (ví dụ: trong các bệnh máu ác tính).
Hạn chế
Giá thành rất cao.

3. Các kỹ thuật di truyền phân tử
a. Phản ứng PCR (polymerase chain reaction)
Nguyên lý
Xuất phát từ cơ chế tự sao của DNA trong tự nhiên.
Khi các điều kiện cần thiết được xây dựng lại trong môi trường thí nghiệm, DNA
của bệnh nhân có thể được phóng đại nhiều lần để phục vụ cho chẩn đoán và cho
các nhu cầu nghiên cứu khác.
Các điều kiện cần thiết bao gồm:
Sự tách rời của hai mạch DNA gốc;
Đoạn mồi;
Sự tổng hợp mạch DNA mới bởi enzyme.
Phương pháp
Chuẩn bị các đoạn mồi (primer) tương ứng với vùng DNA cần được phóng
đại;
Tách rời hai mạch DNA gốc bởi nhiệt (denaturation) (95 - 98°C);
Hạ nhiệt độ vừa đủ nhằm cho phép các đoạn mồi gắn được vào đoạn có trình
tự đặc hiệu tương ứng trên mạch gốc (50 - 65°C);
108

Các kỹ thuật chẩn đoán di truyền
Tổng hợp mạch DNA mới bởi enzyme polymerase bền nhiệt,
Lập lại chu trình nhiều lần.
Vì quá trình tách 2 mạch DNA gốc được thực hiện bởi nhiệt, enzyme sử dụng phải
bền với nhiệt độ cao. Taq polymerase, một enzyme phân lập từ loại vi khuẩn
Thermus aquaticus, có thể trải qua nhiệt độ 98°C trong 25 - 35 chu kỳ mà vẫn giữ
khả năng hoạt động.
Sản phẩm PCR sau đó sẽ được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di (định tính: có sản
phẩm phóng đại hoặc không). Sản phẩm có thể được tinh sạch trước khi sử dụng
cho các kỹ thuật khác.
Cũng dựa trên nguyên lý và kỹ thuật căn bản trên, có thể bổ sung một số bước kỹ
thuật nhằm định lượng sản phẩm PCR (sử dụng các đoạn mồi đánh dấu huỳnh
quang, so sánh với một chứng nội tại). Kỹ thuật này gọi là PCR định lượng
(quantitative PCR).
Kỹ thuật PCR có nhiều ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu và chuẩn đoán.
Thông tin từ kết quả
Thông tin định tính: Có hay không có sự phóng đại đoạn DNA đích.
Thông tin định lượng: So sánh giữa lượng sản phẩm của đoạn DNA đích và của
đoạn DNA chứng (là đoạn DNA bình thường, hiện diện 2 phiên bản trong bộ NST).
Ta có các trường hợp:
Sản phẩm của DNA đích = sản phẩm của DNA chứng nội tại. Kết luận đoạn
DNA đích hiện diện 2 phiên bản trong bộ NST: bình thường.
Sản phẩm của DNA đích = 1/2 sản phẩm của DNA chứng nội tại. Kết luận
đoạn DNA đích hiện diện 1 phiên bản trong bộ NST: mất đoạn, hoặc
monosomy chiếc NST tương ứng.
Sản phẩm của DNA đích = 3/2 sản phẩm của DNA chứng nội tại. Kết luận
đoạn DNA đích hiện diện 3 phiên bản trong bộ NST: nhân đoạn, hoặc
trisomy chiếc NST tương ứng.
Hạn chế
Đoạn mồi PCR cần được tổng hợp đặc hiệu, nên chỉ thực hiện được phản ứng PCR
cho những đoạn DNA đích đã được biết rõ trình tự.
Độ dài các đoạn DNA có thể được phóng đại bằng phản ứng PCR có giới hạn (hiệu
quả nhất là khoảng vài trăm pb đến vài Kb, dài nhất khoảng 20 Kb). Do đó, đây là
kỹ thuật khảo sát rất đặc hiệu và phổ khảo sát hẹp.
109