Tải bản đầy đủ
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tải bản đầy đủ

(a)

(b)

(c)
(d)
Hình 2.1. (a). Rễ, (b). Vỏ rễ trước khi phơi, (c). vỏ rễ sau khi phơi,
(d). Bột vỏ rễ.
2.2. Hóa chất và thiết bị
* Hóa chất: Benzene, Ethyl acetace, Hexan, Ethanol (PA Trung Quốc).
* Thiết bị: Bộ chiết chưng ninh, bếp cách thủy, tủ sấy, lò nung, cân phân tích,
máy đo sắc ký khí kết hợp với phổ khối GC-MS (Trung tâm đo lường chất lượng II,
Đà Nẵng).
Thiết bị phân tích:

25

- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS (Phòng thí nghiệm khoa Sinh,
trường ĐH Sư Phạm – ĐH Đà Nẵng).

Hình 2.2. Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS.
- Máy đo sắc ký khí kết hợp với phổ khối GC-MS Agilent (trung tâm đo lường chất
lượng 2, số 2, Ngô Quyền, Đà Nẵng)

Hình 2.3. thiết bị sắc ký khí khối phổ (GC-MS) Agilent 7890/5975C
Các thông số của thiết bị sắc ký khí khối phổ (GC/MS) Agilent
7890A/5975C:
a

Điều kiện sắc ký
- Nhiệt độ buồng tiêm mẫu: 2800C
- Áp suất: 7.6522 psi
- Tỷ lệ chia dòng: 10:1
- Thể tích tiêm: 1ul
- Chương trình nhiệt độ lò cột: 500C giữ 0 phút

26

Tăng 70C/phút đến 1200C giữ 0 phút
Tăng 10C/phút đến 1650C giữ 0 phút
Tăng 300C/phút đến 3000C giữ 10 phút
5 phút (Post Run)

3200C

- Cột sắc ký mao quản: HP-5: 30m x 250µm x 0.25µm
b) Điều kiện khối phổ
- Kiểu Scan
- Nguồn Ion hóa: EI
- Khoảng phổ quét: 28-600 m/z
- Nhiệt độ nguồn: 2300C
- Nhiệt độ bộ tứ cực: 1500
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp xác định các thông số hoá lý
a. Phương pháp trọng lượng
Độ ẩm của bột vỏ rễ cây chùm ruột và hàm lượng tro của nguyên liệu được
xác dịnh bằng phương pháp trọng lượng.
b. Phương pháp vật lý
 Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS (Atomic Absorption Spectrophotometric).

Hàm lượng một số kim loại nặng có trong mãu nguyên liệu nghiên cứu được
xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS. Các nguyên tử ở
trạng thái bình thường thì chúng không hấp thụ hay bức xạ năng lượng nhưng khi
chúng ở trạng thái tự do dưới dạng những đám hơi nguyên tử thì chúng hấp thụ và
bức xạ năng lượng. Mỗi nguyên tử chỉ hấp thụ những bức xạ nhất định tương ứng
với những bức xạ mà chúng có thể phát ra trong quá trình phát xạ của chúng. Khi
nguyên tử nhận năng lượng chúng chuyển lên mức năng lượng cao hơn gọi là trạng
thái kích thích. Quá trình đó gọi là quá trình hấp thu năng lượng của nguyên tử tự
do ở trạng thái hơi và tạo ra phổ của nguyên tử đó. Phổ sinh ra trong quá trình này
gọi là phổ hấp thụ nguyên tử.[23]
2.3.2. Phương pháp chiết mẫu thực vật
 Kỹ thuật chiết lỏng- lỏng

27

Kỹ thuật này còn gọi là sự chiết bằng dung môi (solvent extraction). Nguyên
tắc cơ bản là sự phân bố của một chất tan vào hai chất lỏng không hoà tan vào nhau.
cao alcol thô ban đầu (ví dụ bột cây được tận trích với Ethanol 80%, đuổi dung môi
thu được cao alcol thô ban đầu) hoặc dung dich ban đầu (ví dụ dung dịch sinh học)
đều chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ từ phân cực đến không phân cực vì thế rất
khó cô lập được riêng những hợp chất tinh khiết để thực hiện các khảo sát tiếp theo.
Kỹ thuật chiết lỏng- lỏng được áp dụng để phân chia cao alcol thô ban đầu hoặc
dung dịch ban đầu thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau. Dung môi
không phân cực (ví dụ như ester dầu hoả, n-hexan…) sẽ hoà tan tốt các hợp chất có
tính không phân cực ( alcol béo, ester béo…), dung môi phân cực trung bình (đietyl
eter, chloroform,…) hoà tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình ( các hợp
chất có chứa nhóm chức eter –O-, aldehyde –CH=O, ceton -CO-…) và dung môi
phân cực mạnh hoà tan tốt các chất có tính phân cực mạnh.
Chiết lỏng- lỏng bằng phễu chiết, trong đó cao alcol thô ban đầu được hoà
tan với nước để chiết ra khỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực khác nhau (tuỳ
vào độ phân cực của dung môi). Tuỳ vào tỷ trọng so sánh giữa dung môi và nước
mà pha hữu cơ nằm ở lớp trên hoặc lớp dưới so với pha nước.
Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến
dung môi phân cực ví du như: eter dầu hoả hoặc n-hexan, eter ethyl, chloroform,
ethyl acetace, butanol,…. Với mỗi loại dung môi khác nhau, việc chiết được thực
hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi, chiết đến khi không còn
chất hoà tan dung môi thì dừng. Khi cho dung dịch chiết lần thứ n lên trên tấm
kiếng sạch, sau khi bay hết dung môi không còn để lại vết gì trên tấm kiếng. [3]
Các yếu tố ảnh hưởng quá trình chiết:
+ Ảnh hưởng của pH
+ Ảnh hưởng của sự tạo thành hợp chất ít tan.
+ Vai trò của sự tạo phức.

28

Hình 2.4. Phễu chiết
 Kỹ thuật chiết rắn –lỏng

Phương pháp chiết nóng (chưng ninh) được tiến hành bằng cách đun hồi lưu
chất rắn với dung môi rồi gạn hoặc lọc thu dịch chiết.
 Chưng cất để loại dung môi

Chưng cất là phương pháp thường dùng để tách biệt và tinh chế những chất
có nhiệt độ sôi khác nhau bằng cách đun sôi chất lỏng thành hơi rồi ngưng tụ hơi lại
thành những chất lỏng tinh khiết. [25]
2.3.3. Phương pháp định danh thành phần hoá học của các dịch chiết
Phương pháp sắc ký khí- khối phổ GC-MS (Gas Chromatography Mass
Spectrometry) là một trong những phương pháp sắc kí hiện đại nhất hiện nay với độ
nhạy và độ đặc hiệu cao, được sử dụng trong việc nghiên cứu và phân tích kết hợp.
Thiết bị được cấu tạo thành 2 phần: phần sắc ký khí (GC) dùng để phân tích hỗn
hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích, phần khối phổ (MS) mô tả các hợp phần
riêng lẻ bằng cách mô tả số khối. Bằng sự kết hợp 2 kỹ thuật này, các nhà hoá học
có thể đánh giá, phân tích định tính và định lượng và có cánh giải quyết với một số
hóa chất. Ngày nay, người ta ứng dụng kỹ thuật GC-MS rất nhiều và sử dụng rộng
raixntrong các nghành y học, môi trường, nông sản, kiểm nghiệm thực phẩm…
Sắc ký khí được dùng để chia tách các hõn hợp của hóa chất ra các phần
riêng lẻ, mổi phần có một giá tri riêng biệt. Trong sắc ký khí chia tách xuất hiện khi
mẫu bơm vào pha động, pha động là một khí trơ. Pha động mang hỗn hợp mẫu đi
qua pha tĩnh, pha tĩnh được sử dụng là hóa chất, hóa chất này có độ nhạy và hấp thụ
thành phần hỗn hợp trong mẫu.
29

Sắc ký ghép khối phổ (GC-MS) có thể phân tích các hỗn hợp hóa chất phức
tạp như không khí, nước... Nếu trong mẫu có một chất lạ xuất hiện, khối phổ có thể
nhận dạng cấu trúc hóa học độc nhất của nó (giống như việc lấy dấu vân tay). Cấu
trúc của chất này sau đó được so sánh với một thư viện cấu trúc các chất đã biết.
Nếu không tìm ra được chất tương ứng trong thư viện thì nhà nghiên cứu có thể dựa
trên cấu trúc mới tìm ra được để phát triển các ý tưởng về cấu trúc hóa học.
Khi GC kết hợp với MS, nó sẽ trở thành 1 máy phân tích đa năng, các nhà
nghiên cứu hóa học có thể hòa tan hỗn hợp các chất hữu cơ, tách chiết và bơm vào
máy để nhận dạng chúng, hơn nữa các nhà nghiên cứu cũng xác định nồng độ của
mỗi thành phần hóa chất. [7,8]
2.4. Các nghiên cứu thực nghiệm
2.4.1. Sơ đồ nghiên cứu
Vỏ rễ cây chùm ruột
(Thu hái ở Liên ChiểuĐà Nẵng)
Để khô tự nhiên, nghiền bột
Bột rễ chùm ruột
Khảo sát yếu tố ảnh hưởng

Độ cồn

Thời gian

Nhiệt độ

Xác định các thông số hoá
lý: Độ ẩm, hàm lượng tro,
hàm lượng kim loại.

Tỷ lệ R/L

Số lần

Chưng ninh với điều kiện khảo sát
Lọc
Dịch chiết
Cô cạn, gộp cao chiết
Hoà tan bằng

Cao chiết

Ethanol

30

Đo GC-MS

Hình 2.5. Sơ đồ nghiên cứu
2.4.2. Xác định các thông số hoá lý
a. Xác định độ ẩm[4]
 Nguyên tắc: làm sức nóng bay hơi hết nước trong mẫu. Cân trọng lượng mẫu

trước và sau khi sấy khô, từ đó tính phần trăm nước có trong mẫu.
 Dụng cụ, thiết bị: cốc sứ để đựng mẫu, cân phân tích, tủ sấy, bình hút
ẩm.
 Tiến hành: chuẩn bị 3 chén sứ và đánh số thứ tự 1 đến 3, các cốc sứ
được rửa sạch và sấy trong tủ sấy đến khối lượng không đổi. Sấy xong
để vào bình hút ẩm cho đến khi đạt nhiệt độ phòng thì cân khối lượng
các chén sứ.
Xác định độ ẩm của bột cây chùm ruột: cho vào mỗi cốc sứ 2.0000g bột và
cân khối lượng cả chén và bột. Ghi lại giá trị khối lượng (m 1). Sau đó, tiến hành sấy
trong tủ sấy ở nhiệt độ 90oC, sau 3h lấy cốc ra cho vào bình hút ẩm cho đến khi
nguội hẳn thì đêm cân. Ghi lại giá trị khối lượng (m2).
31

 Cách tính độ ẩm:

- Độ ẩm mỗi mẫu: W(%) = 100%
- Độ ẩm trung bình WTB(%) = 100%
Trong đó:
m: Khối lượng mẫu bột (g).
m1: Khối lượng chén và mẫu bột trước khi sấy (g).
m2: Khối lượng chén và mẫu bột sau khi sấy (g).
W: Độ ẩm của mỗi mẫu (%).
WTB: Độ ẩm trung bình (%).
b. Xác định hàm lượng tro[5]
 Nguyên tắc: Phá huỷ hợp chất hữu cơ bằng cách nung ở nhiệt độ 500-

6000C đến khối lượng không đổi.
 Dụng cụ: cốc sứ đựng mẫu, lò nung, cân phân tích, bình hút ẩm.
 Tiến hành: lấy cốc sứ sau khi đã xác định độ ẩm, đem tro hoá trong lò
nung ở nhiệt độ 600oC. sau thời gian 20h, ta thấy tro ở dạng bột mịn,
màu trắng xám. Dùng kẹp sắt lấy cốc ra khỏi lò nung, cho vào bình
hút ẩm cho đến khi cốc nguội hẳn thì cân. Ghi khối lượng (m3).
 Cách tính hàm lượng tro:

- Hàm lượng tro mỗi mẫu: H(%) = 100%
- Hàm lượng tro trung bình: HTB(%) = 100%
Trong đó:
m: Khối lượng mẫu bột (g).
m0: Khối lượng chén sứ
m3: Khối lượng chén và mẫu bột sau khi tro hoá (g).
H: Hàm lượng tro trong bột vỏ rễ cây chùm ruột (%).
HTB: Hàm lượng tro trung bình.
c. Xác định hàm lượng một số kim loại nặng [6]
 Nguyên tắc: Mẫu được vô cơ hoá và đo trên máy quang phổ hấp thụ nguyên

tử AAS.
 Tiến hành: Tro thu được sau khi nung đem hoà tan bằng dung dịch nước
cường toan (3ml HCl và 1ml HNO3) định mức bằng nước cất đến 50ml. Lấy
dung dịch đã định mức trên đem xác định hàm lượng một số kim loại nặng là
Cu, Pb, As… bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) tại
phòng thí nghiệm khoa Sinh – Môi trường. Trường ĐH Sư Phạm – ĐH Đà
Nẵng. Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử cao cấp với hiệu chỉnh nền Zeeman
và Deuterium cho hoạt động với ngọn lửa và lò graphite gia nhiệt ngang độc

32

đáo của Analytik- Jena. Nhiệt độ nước làm mát tuần hoàn 380 0C, tốc độ 3
lít/phút, kích thước máy 260/660/560 mm.
 Công thức chuyển đổ hàm lượng mg/l sang mg/kg:
C(mg/kg) V
Trong đó:
m: Khối lượng mẫu bột (kg).
V: Thể tich định mức (ml).
2.4.3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết tách
a. Ảnh hưởng của độ cồn
Chuẩn bị 9 mẫu cho lần lượt vào 9 bình tam giác, mỗi mẫu cân chính xác
trong khoảng 10gam, sau đó cho 100ml dung môi Ethanol lần lượt 0%, 10%, 30%,
40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%. Tiến hành chưng ninh ở nhiệt độ 70oC, thời gian
4h.
Đem lọc đo tỷ trọng và cô cạn dịch chiết, thu được cao chiết ở các độ cồn
khác nhau, đem cân ta được kết quả.
b. Ảnh hưởng của thời gian
Chuẩn bị 6 mẫu cho lần lượt vào 6 bình tam giác, mỗi mẫu cân chính xác
trong khoảng 10gam, sau đó cho 100ml Ethanol 60% vào. Tiến hành chiết chưng
ninh ở nhiệt độ 700C trong khoảng thời giant hay đổi khác nhau: 2, 4, 6, 8, 10, 12h.
Đem lọc, đo tỷ trọng và cô cạn các dịch chiết, thu được cao chiết ở các thời
gian chiết khác nhau, đem cân ta được kết quả.
c. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Chuẩn bị 8 mẫu cho lần lượt vào 8 bình tam giác, mỗi mẫu cân chính xác
trong khoảng 10gam, sau đó cho 100ml dung môi Ethanol 60% vào. Tiến hành chiết
chưng ninh trong khoảng thời gian tốt nhất đã chọn là 8h và với nhiệt độ thay đổi là
45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 900C.
Đem lọc, đo tỷ trọng và cô cạn dịch chiết, thu được cao chiết ở các nhiệt độ
khác nhau. Đem cân ta được kết quả hàm lượng cao chiết.
d. Ảnh hưởng của tỉ lệ rắn-lỏng
Chuẩn bị 6 mẫu cho lần lượt vào 6 bình tam giác, mỗi mẫu cân chính xác trong
khoảng 10gam, sau đó cho dung môi Ethanol 60% vào ở các thể tích thay đổi 50,

33

70, 85, 100, 120, 150ml. Tiến hành chiết chưng ninh ở nhiệt độ 800C trong khoảng
thời gian thích hợp đã chọn là 8h.
Đem lọc, đo tỷ trọng và cô cạn dịch chiết, thu được cao chiết ở các nhiệt độ
khác nhau. Đem cân ta được kết quả hàm lượng cao chiết.
e. Số lần chiết
Cân chính xác khoảng 30gam mẫu cho vào bình cầu 500ml, sau đó cho 300ml
dung môi Ethanol 60% vào. Tiến hành chiết chưng ninh trong khoảng thời gian 8h
với nhiệt độ là 800C.
Đem lọc thu được dịch chiết lần 1, còn bã sau khi lọc ta cho vào bình cầu, thêm
vào 300ml dung môi Ethanol 60% tiếp tục đun trong thời gian và nhiệt độ trên.
Tương tự ta có dịch chiết lần 2, lần 3 và lần 4.
 Cách tính hàm lượng cao chiết:

- Khối lượng cao chiết: m = m2 – m1
- Phần trăm cao chiết: X= 100%
Trong đó:
m0: Khối lượng mẫu đem chiết.
m1: Khối lượng cốc thuỷ tinh.
m2: Khối lượng cốc thuỷ tinh và cao chiết.
m: Khối lượng cao chiểt.
X: Thành phần phần trăm cao chiết.
(Ngoài ra: m1 là khối lượng 50ml dung môi + khối lượng bình tỷ trọng, m 2 là
khối lượng 50ml dịch chiết + khối lượng bình tỷ trọng).
2.4.4. Chiết tách các hợp chất trong vỏ rễ cây chùm ruột từ cao chiết Ethanol
60% qua các phân đoạn chiết lỏng – lỏng.
Cân khoảng 100g bột vỏ rễ chùm ruột, tiến hành chưng ninh với các điều
kiện tối ưu trên. Sau khi chưng ninh xong tiến hành lọc tách riêng dịch chiết và bã.
bã sau khi chưng ninh lần 1 giữ lại tiến hành chưng ninh cho đến khi khối lượng cao
chiết ra được ít thì dừng lại (3-4 lần).
Cô cạn thu được cao chiết.

34

Hình 2.6. Bộ chưng ninh vỏ rễ chùm ruột.
 Chiết lỏng – lỏng bằng các dung môi hữu cơ khác nhau

Cao chiết sau khi gom lại được hoà tan bằng nước cất rồi được chia làm 3
vào bình tam giác có nút nhám và lắc chiết lỏng – lỏng với các dung môi có độ phân
cực tăng dần: Hexan, Benzen, Ethyl acetace.
• Chiết lỏng – lỏng bằng Hexan: Cho tiếp 100ml dung môi Hexan vào một
trong 3 bình tam giác chứa dịch chiết và lắc trong 2h, sau đó cho vào phễu
chiết, để lằng cho đến khi dung dịch trong phễu phân bố thành hai lớp: lớp
dưới là dịch nước, lớp trên là dịch Hexan. Lấy dịch nước cho lại vào bình
tam giác để chiết lần 2 tương tự như trên. Chiết khoảng 5 lần dịch chiết
Hexan trong suốt thì ngừng chiết. Gom phần dịch chiết thu hồi dung môi, cô
cạn thu khối lượng cao chiết, sau đó hoà tan với chính dung môi chiết và gửi


đi đo phổ GC-MS.
Chiết lỏng – lỏng bằng dung môi Benzen: Tiến hành tương tự như dung môi
Hexan. Chiết khoảng 3 lần dịch chiết Benzen trong suốt thì ngừng chiết.
Gom phần dịch chiết thu hồi dung môi rồi cô cạn thu khối lượng cao chiết,

sau đó hoà tan lại bằng chính dung môi chiết và gửi đi đo phổ GC-MS.
• Chiết lỏng – lỏng bằng dung môi Ethyl acetace: Tiến hành tương tự như trên.
Chiết khoảng 8 lần. Gom dịch chiết thu hồi dung môi, cô cạn thu khối lượng
cao chiết, sau đó hoà tan lại với chính dung môi chiết và gửi đi đo phổ GCMS.
35