Tải bản đầy đủ
Phương pháp đo mật độ quang

Phương pháp đo mật độ quang

Tải bản đầy đủ

tiến hành theo 3 cách đó là: đo bằng quang phổ kế, dùng máy đếm điện tử và sử
dụng ống nghiệm có độ đục khác nhau.
− Với việc đo bằng quang phổ kế:
+ Sử dụng chùm sáng đơn sắc chiếu xuyên qua huyền phù chứa VSV cần
đo. Các tế bào VSV trong huyền phù sẽ làm phân tán bớt chùm tia
sáng, tùy theo số lượng nhiều hay ít của chúng trong mẫu. Số tia sáng
còn lại đi qua mẫu sẽ kích thích một tế bào quang điện. Cường độ
chùm sáng đi qua sẽ làm dịch chuyển cây kim trên thước đo, cho ta
biết phần trăm ánh sáng bị phân tán trên bảng chỉ thị. Từ kết quả thu
được ta mang đối chiếu với một bảng chuẩn và kết hợp với độ pha
loãng để biết được mật độ VSV trong mẫu.

+

+

Lượng ánh sáng truyền qua mấu sinh khối tỉ lệ thuận với lượng tế bào
và có thể tính theo công thức sau:
T=
Trong đó:
Để có được đơn vị đo thích hợp, người ta sử dụng đơn vị hấp thụ ánh
sáng của vật chất A (Absorance) thay cho đơn vị truyền ánh sáng T. Ta
có mối liên hệ:

Độ hấp thụ tăng tỉ lệ thuận với mật độ tế bào. Thuật ngữ độ hấp thụ (A)
còn được gọi là mật độ quang (OD)
Cách đo thứ 2 là sử dụng máy đếm điện tử, có thể đo được hàng ngàn tế
bào trong vòng vài giây. Nguyên tắc của phép đo này là tế bào được đưa

+


11

qua tia sáng của máy điện tử, VSV cản tia sáng và ghi dấu hiệu trên bộ
đếm của máy.
− Cách thứ 3 là sử dụng ống nghiệm có độ đục khác nhau (dãy ống nghiệm
Macfaland). Một dãy ống nghiệm chứa BaSO4 có độ pha loãng khác nhau
tương ứng với độ pha loãng có bảng đối chiếu của nồng độ vi khuẩn tương
ứng. Đối chiếu độ đục của ống nghiệm chứa mẫu cần đo với dãy ống
nghiệm Macfaland, sau đó đối chiếu với bảng ta sẽ biết được nồng độ của
vi khuẩn tương ứng.
b. Cách tiến hành:
∗ Phương pháp đo bằng quang phổ kế:
Tế bào VSV có chứa nhiều phân tử có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước
sóng khác nhau (AND từ 254-260nm; protein 280nm; xitocrom 400-500nm…)
Khi đo độ đục tế bào người ta thường chọn các bước sóng có độ hấp thụ nhỏ, hay
dùng nhất là bước sóng 600-620nm. Tùy vào đối tượng mang đo mà ta chọn
bước sóng cho phù hợp. Bên cạnh đó, do sự ảnh hưởng của thành phần bên trong
tế bào đối với sự khuếch tán hay hấp thụ ánh sáng mà phương pháp này có tính
đặc thù riêng với mỗi loại VSV.
Tiến hành đo:
− Lấy 1 ống nghiệm chứa mẫu VSV cần đo và 4 ống nghiệm vô trùng, tiến
hành pha loãng theo dãy thập phân.
− Chuẩn bị máy quang phổ đo độ đục, có thể sử dụng máy quang phổ đơn
giản hoặc máy quang phổ UV-vis
− Tiến hành đo độ đục của các mẫu đã pha loãng trên quang phổ kế ở
620nm, ứng với mỗi độ pha loãng mẫu sẽ thu được một giá trị OD. Theo
định luật Lambert thì độ hấp thụ chỉ tỉ lệ thuận với mật độ VSV trong
khoảng giá trị từ 0.1-0.8. Nếu lớn hơn 0.8 thì mật độ vật chất cao, các
VSV sẽ tạo ra các bóng che khuất nhau làm cho sai lệch kết quả.
− Song song với việc đo độ đục cần tiến hành nuôi cấy và đếm số lượng tế
bào ở các độ pha loãng tương ứng trên môi trường thạch, từ đó thiết lập
hàm tương quan giữa độ hấp thụ và số lượng tế bào sống. Hàm có dạng
bậc nhất:
A = a. + b
Trong đó:

12










c.




Sau khi xây dựng được hàm tương quan, các lần đo tiếp theo ta chỉ cần đo
giá trị mật độ quang (OD) rồi sau đó dựa vào hàm tương quan để tính toán
ra mật độ VSV trong mẫu
Phương pháp dãy ống nghiệm có độ đục khác nhau (dãy ống nghiệm
Macfaland)
Dùng 10 ống nghiệm sạch, trong, có kích thước bằng nhau. Nhỏ vào mỗi
ống một lượng dung dịch BaCl2 theo thứ tự từ ống 1 đến ống 10, ống 1
nhỏ 0,1ml, ống 2 nhỏ 0,2ml,.. cứ thế đến ống 10 là 1ml. Tiếp theo cho vào
mỗi ống vừa đủ 10ml dung dịch H2SO4 và hàn kín miệng ống.
Lấy ống nghiệm chứa mẫu cần đo cho vào máy li tâm, gạn rửa. Cho nước
cất vào tiếp tục li tâm, gạn rửa 2-3 lần nữa. Cuối cùng cho nước cất vào
một lượng ngang với lượng dung dịch nuôi cấy.
Đặt ống nghiệm chứa VSV đã gạn rửa vào giữa 2 ống Macfaland áng
chừng có màu tương tự. Số lượng VSV có trong 1ml dung dịch sẽ nằm
trong khoảng 2 mức chuẩn của ống Macfaland.

Ưu – nhược điểm:
Ưu điểm: phương pháp đo mật độ quang cho kết quả nhanh chóng, dễ
dàng, phương pháp đo với máy quang phổ thường được ứng dụng để theo
dõi, nghiên cứu sự sinh trưởng của VSV trong PTN hoặc trong sản xuất.
Việc đo độ đục với máy quang phổ có thể phân biệt được tế bào sống và tế
bào chết.
Nhược điểm:
+ Phương pháp đo với máy quang phổ dễ bị sai số do thao tác và sai số
của máy đo

13

+ Phương pháp dãy ống nghiệm Macfaland cho kết quả rơi vào một
khoảng, không phải mật độ cụ thể
+ Cần lưu ý khi pha loãng mẫu để đo trên máy quang phổ cần pha sao cho
OD rơi vào khoảng <0.8
Phương pháp đo sinh khối:
Sự tăng trưởng của vi sinh vật là sự gia tăng về số lượng cá thể trong quần
thể, khi số lượng tăng lên sẽ đi kèm với sự tăng lên của sinh khối. Mặt khác, hàm
lượng độc tố có liên quan mật thiết với lượng chất khô trong mẫu hơn là số
lượng cá thể, nên số lượng cá thể chưa phải là thước đo lý tưởng để đánh giá
kích thước quần thể hay độc tính tiềm tàng. Do đó, trong nghiên cứu thường sử
dụng phương pháp đo sinh khối vi sinh vật.
Có 2 phương pháp đo sinh khối là đếm số lượng tế bào và xác định hàm
lượng sắc tố.
3.1.
Phương pháp đếm và xác định thể tích tế bào:
Nguyên tắc:
− Thể tích sinh học (biovolume) có thể đạt được từ số lượng tế bào bằng
cách xác định thể tích trung bình của tế bào từng loài hay đơn vị đếm rồi
nhân với số lượng tế bào hiện có trong mẫu. Kết quả là tổng thể tích của
mỗi loài.
− Với tế bào phù du thì 1mm 3 được coi là 1mg, thể tích sinh học tương ứng
với sinh khối.
− Thể tích trung bình xác định bằng cách giả dịnh một kiểu hình học cho
mỗi loài (đối với tế bào Microcystis được coi là hình cầu), đo độ dài hình
học của 20-30 tế bào (phụ thuộc độ biến động) của loài và tính toán thể
tích trung bình tương ứng.
3.

Ví dụ: để xác định 20 tế bào Microcystis, có đường kính trung bình là
5μm. Với giả định dạng hình học của tế bào là hình cầu ta sẽ tính được thể tích tế
bào trung bình là 4/3πr3 = 65,4μm3. Theo thống kê có khoảng 1 triệu tế bào trong
1mL như vậy tổng thể tích sinh học là 65,4.106μm3mL-1
Xét ví dụ 2: Đo 30 tế bào hình sợi Planktothrix cho kết quả chiều dài trung
bình là 225μm và đường kính trung bình là 6μm. Giả định tế bào có hình trụ, khi
đó thể tích trung bình là 2πr2.L=6,359μm3. Thống kê cho thấy có khoảng 10000
14

tế bào sợi trong 1mL. Như vậy thể tích sinh học của Planktothrix là
63,6.106μm3mL-1.

Hình ảnh tế bào Microcystis

Công thức tính thể tích tế bào hình cầu
(V là thể tích tế bào hình câu; A là diện tích bề mặt; r là bán kính mặt cắt;
d là đường kính mặt cắt)

Hình ảnh tế bào sợi Planktothrix

Công thức thể tích tế bào hình trụ (h: đường cao, d: đường kính đáy)

15