Tải bản đầy đủ
b. Phương pháp tiến hành:

b. Phương pháp tiến hành:

Tải bản đầy đủ



+ Đốt que cấy, để nguội, dùng cạnh vòng cấy ở đầu que dàn đều giọt mẫu
ra xung quanh, vừa chạm vào cạnh hình vuông.
+ Cố định tiêu bản, nhuộm đơn bằng thuốc nhuộm blue methylen.
+ Nhỏ một giọt dầu soi, xem ở vật kính x100.
Cách đếm:
+ Đếm số tế bào VSV trên 1 đơn vị vi trường (VT)
+ Đếm hết tất cả 30 – 50 VT/ hình vuông phết kính

Sơ đồ di chuyển vật kính trong hình vuông phết kính để đếm số VSV/1VT


Công thức tính mật độ tế bào trong mẫu:
Số tế bào/1ml mẫu =
Trong đó:

X là số vi khuẩn đếm được trong một V
S là diện tích hình vuông phết kính (400mm2)
S

là diện tích 1 vi trường, πR2=0.0004mm2
6

=> số lượng vi trường có trong S
V là thể tích giọt vi khuẩn phết kính
H là hệ số pha loãng mẫu



Phương pháp đếm trực tiếp trong buồng đếm:
Để quan sát vi tảo thông thường sẽ sử dụng buồng đếm hồng ngoại.
Cấu tạo buồng đếm:
+ Buồng đếm là một phiến kính trong, dày từ 2-3mm, hình chữ nhật
+ Giữa phiến kính là một phần lõm phẳng làm đĩa đếm, có kẻ một hoặc
hai khung đếm gồm 400 ô nhỏ, xung quanh có một rãnh nhỏ. Đĩa đếm
thấp hơn bề mặt phiến kính khoảng 1/10mm, có hình tròn vì thế khi phủ
lên bằng một lá kính thì độ sâu của đĩa đếm sẽ đồng đều nhau. Vùng đĩa
đếm có diện tích 1mm2. Bên ngoài buồng đếm có ghi tên loại buồng đếm
và một số thông số kĩ thuật đặc trưng:

Cấu tạo buồng đếm


Cấu tạo khung đếm đĩa đếm: khung đếm thường có cấu tạo
+ Trường hợp 1: khung đếm có 16 ô lớn, mỗi ô lớn có 25 ô nhỏ. Một
khung do đó có 400 ô nhỏ
+ Trường hợp 2: khung đếm có 25 ô lớn, mỗi ô lớn có 16 ô nhỏ. Một
khung do đó có 400 ô nhỏ
+ Diện tích 1 ô nhỏ là 1/400mm2
Vậy thể tích 1 ô nhỏ là V= 0.1mm x 1/400mm2 = 1/4000mm3

7

Cấu tạo khung đếm


Cách tiến hành:
+ Trước khi tiến hành quan sát cần cho thêm vài giọt fomalin vào trong
mẫu, trộn đều
+ Đặt lammen sạch phủ lên khung đếm
+ Lắc mạnh dịch huyền phù đã pha loãng, sau đó dùng pipet hút dung dịch
mẫu đã pha loãng, bỏ đi vài giọt đầu.
+ Dùng đầu pipet đặt vào cạnh buồng đếm tiếp giáp lammen kính, dịch
huyền phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơ chế mao dẫn. Buồng đếm được
8

chuẩn bị đúng khi chỉ có vùng không gian nằm giữa lá kính và buồng đếm
được phủ bởi dịch huyền phù tế bào, còn các rãnh chung quanh thì không
bị dính ướt.
+ Di chuyển nhẹ nhàng khung đếm để dịch huyền phù tràn sang các
khoang. Khi đó dịch trong khoang có độ dày 0.1mm
+ Đặt buồng đếm lên bàn kẹp của kính hiển vi, dùng kẹp cố định buồng
đếm
+ Thao tác, điều chỉnh kính hiển vi, ban đầu dùng vật kính x10 để điều
chỉnh sơ bộ trước, sau đó sử dụng vật kính x40 để quan sát và đếm. Chú ý
bắt đầu đếm sau khi nhỏ giọt dung dịch từ 3-5’
+ Đếm số tế bào có trong 5 ô lớn (4 ô ở cạnh và 1 ô ở giữa), đếm lần lượt
từng ô nhỏ trong 1 ô lớn. Trong tất cả các ô nhỏ cần đếm số tế bào nằm
hẳn trong ô trước, sau đó đếm các tế bào ở cạnh bên trên và bên phải ô
+ Đếm tất cả 80 ô nhỏ trong 5 ô lớn (TH1: 1 ô lớn có 16 ô nhỏ)
+ Đếm tất cả 125 ô nhỏ trong 5 ô lớn (TH2: 1 ô lớn có 25 ô nhỏ)

Thao tác thực hiện đếm số tế bào

9



Công thức tính:
Số tế bào/1ml mẫu =
Trong đó:



a là số tế bào trung bình có trong 1 ô nhỏ
V là thể tích của 1 ô nhỏ (tính theo ml)
H là hệ số pha loãng

Một số chú ý:

+ Nên tiến hành nhuộm màu tiêu bản (methylen blue) để dễ quan sát và
đếm chính xác
+ Nồng độ dịch huyền phù pha loãng thích hợp sao cho mật độ trong mỗi
ô nhỏ không úa 10 tế bào
+ Sử dụng buồng đếm xong phải rửa buồng đếm ngay và lau khô
+ Để đạt độ chính xác cao, mật độ trung bình của tế bào đếm được trong 1
ô nhỏ vào khoảng 2.5 < a < 10
c.



Ưu – nhược điểm:
Ưu điểm: phương pháp đếm trực tiếp có ưu điểm là có thể nhanh chóng
xác định được nhanh chóng mật độ VSV trong mẫu, thao tác đơn giản
Nhược điểm:
+ Không nhận biết được tế bào VSV sống và các tế bào chết
+ Dễ nhầm lẫn tế bào VSV với các dị thể trong mẫu
+ Độ chính xác ở mức tương đối
+ Không phù hợp với huyền phù VSV có mật độ thấp

Phương pháp đo mật độ quang
Nguyên tắc:
Số lượng VSV có trong mẫu có thể được xác định gián tiếp thông qua
phương pháp đo độ đục hay đo mật độ quang. Nguyên tắc chung của phương
pháp này là sự tương quan giữa nồng độ, hay mật độ tế bào VSV và số lượng
photon trong ánh sáng bị phân tán (thông thường với các mẫu không quá đậm
đặc thì mật độ VSV tỉ lệ thuận với số photon bị phân tán). Việc đo độ đục có thể
2.
a.

10

tiến hành theo 3 cách đó là: đo bằng quang phổ kế, dùng máy đếm điện tử và sử
dụng ống nghiệm có độ đục khác nhau.
− Với việc đo bằng quang phổ kế:
+ Sử dụng chùm sáng đơn sắc chiếu xuyên qua huyền phù chứa VSV cần
đo. Các tế bào VSV trong huyền phù sẽ làm phân tán bớt chùm tia
sáng, tùy theo số lượng nhiều hay ít của chúng trong mẫu. Số tia sáng
còn lại đi qua mẫu sẽ kích thích một tế bào quang điện. Cường độ
chùm sáng đi qua sẽ làm dịch chuyển cây kim trên thước đo, cho ta
biết phần trăm ánh sáng bị phân tán trên bảng chỉ thị. Từ kết quả thu
được ta mang đối chiếu với một bảng chuẩn và kết hợp với độ pha
loãng để biết được mật độ VSV trong mẫu.

+

+

Lượng ánh sáng truyền qua mấu sinh khối tỉ lệ thuận với lượng tế bào
và có thể tính theo công thức sau:
T=
Trong đó:
Để có được đơn vị đo thích hợp, người ta sử dụng đơn vị hấp thụ ánh
sáng của vật chất A (Absorance) thay cho đơn vị truyền ánh sáng T. Ta
có mối liên hệ:

Độ hấp thụ tăng tỉ lệ thuận với mật độ tế bào. Thuật ngữ độ hấp thụ (A)
còn được gọi là mật độ quang (OD)
Cách đo thứ 2 là sử dụng máy đếm điện tử, có thể đo được hàng ngàn tế
bào trong vòng vài giây. Nguyên tắc của phép đo này là tế bào được đưa

+


11